电化学指纹图谱技术鉴别黄酒品种和陈酿年份

张南南 吴小红 王铭洲 曹 辉 夏 捷 金建忠

（浙江树人大学生物与环境工程学院 杭州310015）

黄酒是我国的古老酒种，源于中国，与啤酒、葡萄油并称为世界三大古酒。黄酒香气浓郁，味美甘甜，风味醇厚，并含有氨基酸、糖、有机酸和多种维生素等营养成分。不同陈酿年份的黄酒品质和价格差距较大。然而，黄酒生产和陈酿过程中无统一的评价和检测标准，少数企业有随意标注酒龄的行为[1]，如市售黄酒中存在以低酒龄黄酒冒充高酒龄黄酒的所谓“八年陈黄酒”、“十年陈黄酒”。鉴于此，建立一套快速、简便、有效的评价系统，对黄酒品种和陈酿年份的鉴别有极其重要的作用。

指纹图谱是经光谱或色谱等现代分析仪器测定得到的组分群体的特征图谱或图像。指纹图谱能较充分地反映酒中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价[2]。酒类指纹图谱研究较多的是葡萄酒[3-6]和白酒[7-10]，对黄酒研究得较少[1，11]，大多采用气相色谱法、高效液相色谱法及高级仪器联用技术。现有方法均需对酒类样品进行预处理，设备昂贵，操作复杂。电化学指纹图谱具有样品无需预处理，灵敏，操作简单的特点，近年来广泛应用于中草药的鉴别[12-14]。

本试验中采用H2SO4-（NH4）4Ce（SO4）4-CH2（COOH）2-KBrO3振荡体系，系统考察振荡体系各因素对黄酒电化学指纹图谱的影响，在最佳测定条件下建立会稽山不同品种和陈酿年份黄酒的指纹图谱，用于黄酒陈酿年份和品种的鉴别。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纯和十二年绍兴花雕酒、纯和八年绍兴花雕酒、古酿六年绍兴花雕酒、古酿三年绍兴花雕酒、纯正五年绍兴酒、醇香三年黄酒、宋法原造三年陈绍兴花雕酒，产自会稽山绍兴酒股份有限公司。

硫酸、溴酸钾、丙二酸、硫酸铈铵均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

CHI620E 型电化学工作站，上海辰华仪器有限公司；RTC 基本型磁力搅拌器+ETS D5，德国IKA；217 型饱和甘汞电极、213 型铂电极，天津艾达恒晟科技发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 电化学指纹图谱测定 量取一定量的黄酒加入反应器中，在保持反应总体积100 mL 的前提下依次加入一定量的硫酸、硫酸铈铵和丙二酸溶液，在设定温度和搅拌速度下恒温搅拌10 min后加入一定量溴酸钾，继续恒温搅拌。以217 饱和甘汞电极作参比，213 型铂电极作指示电极，以溴酸钾加入时计时，记录电化学振荡体系中电位（E）随时间（t）的变化，获取黄酒电化学指纹图谱特征参数，绘制E-t 曲线。

1.3.2 系统相似度计算方法 参照方宣启等[15]报道的系统相似度计算方法，以各种黄酒电化学指纹图谱平均参数为参照，计算黄酒指纹图谱系统相似度，计算公式如下：

式中：Q积——系统相似度；n——参数的个数；ai，bi——每个图谱第i 个参数的平均值或对应的第i 个参数。

2 结果与分析

2.1 黄酒电化学指纹图谱测定条件

选取会稽山醇香三年黄酒与纯正五年绍兴酒做对比试验，以诱导时间、最大振幅、振荡寿命、最高电位和最低电位5 个电化学指纹图谱特征参数的差值最大化为目标，做单因素试验，研究温度、转速、硫酸铈铵浓度、氢离子浓度、丙二酸浓度、溴酸钾及黄酒用量等因素对黄酒电化学指纹图谱的影响，确定最佳的电化学指纹图谱测定条件。

2.1.1 温度对黄酒电化学指纹图谱的影响 在其它条件（6.00 mL 黄酒，转速850 r/min，氢离子浓度2.000 mol/L，硫酸铈铵0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸钾1.116 g） 不变的情况下，分别在34，35，36，37，38，39，40℃测定所选2 种黄酒的电化学指纹图谱，研究温度对黄酒电化学指纹图谱的影响，结果见图1和表1。试验表明：温度太低振荡不明显，34℃时会稽山纯正五年绍兴酒几乎无振荡产生，故舍去；39℃时诱导时间差、最低电位差、振荡寿命差以及最大振幅差均为最大值，因此选取39℃为最适温度。

图1 不同温度下黄酒的电化学指纹图谱Fig.1 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different temperatures

表1 不同温度下会稽山醇香三年黄酒和纯正五年绍兴酒的电化学指纹图谱特征参数差值Table 1 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different temperatures

2.1.2 黄酒加入量对黄酒电化学指纹图谱的影响在其它条件（温度39℃，转速850 r/min，氢离子浓度2.000 mol/L，硫酸铈铵0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸钾1.116g） 不变的情况下，分别加入8.00，4.00，2.00，1.60，1.40，1.20 mL黄酒做试验，黄酒加入量对黄酒电化学指纹图谱的影响见图2和表2。加入黄酒8.00 mL 时几乎看不到振荡曲线，随着黄酒量的减少，振荡寿命和振荡幅度增加，当黄酒加入量为1.40 mL 时图谱差距最大。最终选择1.40 mL 为黄酒最佳加入量。

2.1.3 转速对黄酒电化学指纹图谱的影响 在其它条件 （1.40 mL 黄酒，温度39 ℃，氢离子浓度2.000 mol/L，硫酸铈铵0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸钾1.116 g） 不变的情况下，分别在850，800，750，700，650，600 r/min 转速下做试验，考察搅拌速度对黄酒电化学指纹图谱的影响，结果见图3和表3。当转速为650 r/min 时两种黄酒的图谱参数相差最大。最终选择650 r/min为最佳转速。

图2 不同黄酒加入量的电化学指纹图谱Fig.2 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different dosages

表2 不同黄酒加入量的会稽山醇香三年黄酒和纯正五年绍兴酒的电化学指纹图谱特征参数差值Table 2 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different Chinese rice wine dosages

图3 不同转速下黄酒的电化学指纹图谱Fig.3 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different stirring rates

表3 不同转速下会稽山醇香三年黄酒和纯正五年绍兴酒的电化学指纹图谱特征参数差值Table 3 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different stirring rates

2.1.4 溴酸钾浓度对黄酒电化学指纹图谱的影响在其它条件（1.40 mL 黄酒，温度39℃，转速650 r/min，氢离子浓度2.000 mol/L，硫酸铈铵0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L） 不变的情况下，分别加入溴酸钾0.8484 g （0.05080 mol/L）、0.9280 g（0.05880 mol/L）、1.116 g （0.06680 mol/L）、1.249 g（0.07480 mol/L）做试验，考察溴酸钾浓度对黄酒电化学指纹图谱的影响（图4和表4）。随着溴酸钾浓度增大，振荡曲线的振荡寿命延长，当溴酸钾用量1.116 g，溶液中浓度为0.06680 mol/L 时，两张图谱的参数差值最大，最终选择溴酸钾1.116 g 为最佳条件。

图4 同溴酸钾浓度下黄酒的电化学指纹图谱Fig.4 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different KBrO3 concentrations

表4 不同溴酸钾浓度下会稽山醇香三年黄酒和纯正五年绍兴酒的电化学指纹图谱特征参数差值Table 4 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different KBrO3 concentrationas

2.1.5 硫酸铈铵浓度对黄酒电化学指纹图谱的影响 在其它条件 （1.40 mL 黄酒，温度39 ℃，转速650 r/min，氢离子浓度2.000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸钾1.116 g） 不变的情况下，分別加入0.1000 mol/L 硫酸铈铵溶液4.00，5.00，6.00，7.00，8.00 mL，其浓度分别为0.004000，0.005000，0.006000，0.007000，0.008000 mol/L，考察硫酸铈铵浓度对黄酒电化学指纹图谱的影响（图5和表5）。当溶液中硫酸铈铵浓度为0.006000 mol/L 时，图谱参数相差最大，为试验最佳条件。

图5 不同硫酸铈铵浓度下黄酒的电化学指纹图谱Fig.5 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different （NH4）4Ce（SO4）4 concentrations

表5 不同硫酸铈铵浓度下会稽山醇香三年黄酒和纯正五年绍兴酒的电化学指纹图谱特征参数差值Table 5 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different （NH4）4Ce（SO4）4 concentrations

2.1.6 氢离子浓度对黄酒电化学指纹图谱的影响在其它条件 （1.40 mL 黄酒，温度39 ℃，转速650 r/min，硫酸铈铵0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸钾1.116 g），分别在氢离子浓度 为2.000，1.800，1.600，1.400、1.200 mol/L 的条件下试验，考察氢离子浓度对黄酒电化学指纹图谱的影响（图6和表6）。当溶液中氢离子浓度为1.800 mol/L 时图谱参数相差最大，为试验最佳条件。

图6 不同氢离子浓度下黄酒的电化学指纹图谱Fig.6 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different hydrogen ion concentrations

表6 不同氢离子浓度下会稽山醇香三年黄酒和纯正五年绍兴酒的电化学指纹图谱特征参数差值Table 6 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different hydrogen ion concentrations

2.1.7 丙二酸浓度对黄酒电化学指纹图谱的影响在其它条件 （1.40 mL 黄酒，温度39 ℃，转速650 r/min，硫酸铈铵0.006000 mol/L，氢离子浓度1.800 mol/L，溴酸钾1.116 g） 不变的情况下，分別加 入1.000 mol/L 丙 二 酸10.00，8.00，6.00，4.00 mL（浓度分別为0.1000，0.08000，0.06000，0.04000 mol/L）做试验，其黄酒电化学指纹图谱见图7和表7。当丙二酸加入量为4.00 mL 时因丙二酸不足而导致振荡效果不佳；当丙二酸加入量为6.00 mL 时振荡时间过长，醇香三年甚至超过1 h；当丙二酸加入量为8.00 mL 比加入量10.00 mL 时参数相差大，最终选择8.00 mL（0.08000 mol/L）为最佳条件。

图7 不同丙二酸浓度下黄酒的电化学指纹图谱Fig.7 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different CH2（COOH）2 concentrations

表7 不同丙二酸浓度下会稽山醇香三年黄酒和纯正五年绍兴酒的电化学指纹图谱特征参数差值Table 7 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different CH2（COOH）2 concentrations

2.2 黄酒电化学指纹谱库建立及相似度判断

在上述试验确定的最佳黄酒电化学指纹图谱测定条件下，对7 种会稽山公司生产的不同品种和陈酿年份黄酒进行测定。分别平行测定3 份，建立其电化学指纹谱库（图8和表8），并以各种黄酒电化学指纹图谱平均参数为参照，计算黄酒电化学指纹图谱系统相似度（结果见表9）。

结果显示：同种黄酒电化学指纹图谱的系统相似度在98.03%～99.57%范围，不同种黄酒的系统相似度在83.36%～97.14%范围。以临界系统相似度Qc=（97.14%+98.03%）/2=97.59%作为鉴别品种的判据，即电化学指纹图谱系统相似度＞97.59%时属同种黄酒，当相似度≤97.59%时为非同种黄酒。

表8 会稽山黄酒电化学指纹图谱参数Table 8 The charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan Chinese rice wine

（续表8）

表9 以各种黄酒电化学指纹图谱参数为参照计算的黄酒指纹图谱系统相似度Table 9 The system similarities of electrochemical fingerprints of Chinese rice wine based on electrochemical fingerprint parameters of all kinds of Chinese rice wine

图8 黄酒电化学指纹图谱Fig.8 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine

3 结论

选 用H2SO4-（NH4）4Ce（SO4）4-CH2（COOH）2-KBrO3为振荡体系，确定黄酒电化学指纹图谱最佳的测定条件为：溶液总体积100 mL，温度39℃，转速650 r/min，硫酸铈铵浓度0.006000 mol/L，氢离子浓度1.800 mol/L，丙二酸浓度0.08000 mol/L，溴酸钾1.116 g，黄酒1.40 mL。不同品种和陈酿年份黄酒的电化学指纹图谱主要特征参数存在着显著差异，并有很好的稳定性和重现性。采用电化学指纹图谱系统相似度可识别黄酒的品种和陈酿年份，当电化学指纹图谱系统相似度＞97.59%时属同种黄酒，当相似度≤97.59%时为非同种黄酒。本研究为不同黄酒品种和陈酿年份的鉴别提供了一种简便方法。