5种蔬菜和水果抑制血管紧张素转化酶的研究

王向阳 从俊峰 顾 双

（浙江工商大学食品与生物工程学院 杭州310000）

高血压作为影响心血管病的主要因素，往往是人们长期饮食高能量的食物以及缺乏运动造成的。因长期患有高血压会使得血管、心脏、肺和肾脏等功能性器官发生病变，进而引发脑卒中、冠心病等多种并发症而广泛引起人们的注意。血管紧张素转化酶（ACE）作为人体肾素-血管紧张素系统（RAS）中对血压有调节作用的一种关键酶，通过抑制ACE 的酶活性，不仅能够减少体内具有强烈收缩血管作用的血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的生成量，还能够减少激肽释放酶-激肽系统（KKS）中具有血管舒张作用的缓激肽（BK）被降解量[1]。寻找有效的ACE 抑制剂引起人们极大的兴趣。果蔬作为日常食物，食用量大，其可能影响ACE 活性。

目前，关于ACE 抑制剂的报道大多是以动、植物蛋白为原料，通过不同的方法获得具有ACE抑制活性的多肽，ACE 抑制肽的制备方法主要有水解法（包括酸、碱水解法和酶的水解法）、微生物发酵法、人工合成法（包括化学合成法和DNA 重组法）等[2]。

食源性ACE 抑制肽具有安全有效、无副作用、吸收效果好等特点，可将其应用于功能性食品或者膳食补充剂来预防和缓解高血压。近年来，国内外学者利用麦胚、大豆、核桃、花生、苋菜白蛋白、豌豆、红松仁清蛋白等多种原料制备出ACE抑制肽[3-5]。如吴继红等[6]在白酒中发现一种氨基酸序列为Pro-His-Pro 的多肽，具有明显抑制ACE活性的作用。徐怀德等[7]利用木瓜蛋白酶水解核桃蛋白并分离纯化获得的多肽具有较高的ACE 抑制活性，最高达93.56%。

海洋生物也是研究ACE 抑制肽的热点，沙丁鱼、毛虾、海蜇、鲶鱼、黑鱼等均是良好的ACE 抑制肽的蛋白源[8]。Ichimuraa 等[9]从发酵的鱼酱中分离得到具有很强ACE 抑制活性的二肽，结构为Ala-Pro 的二肽，IC50为29 μmol/L。苑园园等[10]发现胃蛋白酶酶解牡蛎得到的多肽抑制ACE 效果最好。He 等[11]对三肽的QSAR 模型研究表明：当N-端为疏水性氨基酸，中间氨基酸为带正电荷的氨基酸Lys 或Arg 等，C-末端为体积和疏水性都较大的芳香族氨基酸时，三肽具有最高的ACE 抑制活性。胃蛋白酶对含有芳香族和脂肪族氨基酸的多肽具有很强的酶切特异性，而且优先切割C-产生Phe 和Leu，此类多肽往往具有ACE 抑制作用[12]。

此外，也有报道非多肽物质具有ACE 抑制效果，黄酮类及其它多酚类物质作为食品添加剂往往也具有ACE 抑制活性[13-15]。王艺璇等[16]发现苹果多酚类物质中黄烷醇类对ACE 有较高抑制活性。Huey-Mei Shaw 等[17]报道丁香罗勒的水提取物不仅在体外具有ACE 抑制活性，对体内自发性高血压大鼠（SHR）也具有降压效果。Brasil 等[18]用甲醇提取番木瓜中的物质，经LC-MS/MS 鉴定为黄酮类物质，该黄酮类物质在体内具有降血压效果。Ronchi 等[19]用乙醇提取芒果叶，叶中的阿魏酸、没食子酸等对体外ACE 具有抑制活性，在体内也具有降压效果，提取液对ACE 的抑制率最高达（90±8）%。王艺璇等[16]研究不同成熟度的苹果内多酚物质对ACE 酶活性的抑制情况，未成熟的苹果多酚物质对ACE 的抑制效果最好。Lucas 等[20]研究葡萄酒、茶、巧克力等物质对ACE 活性的抑制效果，原花青素低聚体具有显著的酶抑制活性，黄烷醇物质的含量和其对ACE 活性的抑制能力呈正相关。

ACE 抑制剂是在体外对ACE 酶活性具有抑制作用的一类物质，由于其被人体消化吸收时会被各种消化酶水解，原本具有ACE 抑制活性的物质可能完全失活或部分活性被抑制，相反，无活性的物质可能经消化道和胃液作用后产生的新物质具有很高的ACE 抑制活性，因此体外具有ACE抑制活性的物质口服后不能确定一定具有降压作用[21]。若要ACE 抑制剂在体内发挥降压作用，还需要进行体外模拟消化实验或动物实验。

本试验前期对果蔬ACE 酶的抑制效果进行了筛选，最终选取西兰花、大蒜、菠菜、平菇和猕猴桃等5 种果蔬为原料，通过水提、醇提以及胃蛋白酶酶解处理的方式获得不同提取物，测定ACE 抑制率。对提取物进行复配，以期获得ACE 抑制效果的增效作用，并做体内模拟实验，旨在为开发和利用常见食物在高血压病防治上的应用。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

蔬菜（西兰花、大蒜、菠菜）和水果（平菇和猕猴桃），购于杭州下沙的鑫永涛生活超市。

四硼酸钠、硼酸、无水乙醇，分析纯，成都市科龙试剂化学厂；胃蛋白酶（1∶3 000）、胰蛋白酶（1∶250），国药集团化学试剂有限公司；盐酸、氢氧化钠，分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；马尿酰-组氨酰-亮氨酸（HHL）、马尿酸（HA）标准品，美国SIGMA 公司；甲醇、三氟乙酸，色谱纯，美国J.T.Baker 公司；ACE 酶，实验室自备，从猪肺中提取，酶比活力为119.2 U/g。

1.2 主要仪器与设备

紫外分光光度计（UV-2600），日本Shimadzu公司；高效液相色谱仪（LC-20AT），日本Shimadzu公司；旋转蒸发仪（R-210），瑞士BUCHI 公司；高速冷冻离心机（2-16KL），美国SIGMA 公司；冷冻干燥机（A65312906），美国LABCONCO 公司；台式均质机（D18TS25），艾卡（广州）仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蔬菜和水果提取物的制备 取30 g 蔬菜和水果以1∶3（质量比）的比例和蒸馏水进行匀浆处理，匀浆2 min。取匀浆液30 mL，冷冻干燥。各取冻干粉50 mg，均配制为25 mg/mL 的溶液。（1）水提：加2 mL 水，80 ℃加热10 min，15 ℃，6 000 r/min 离心20 min，取上清提取液于-80℃冷冻。（2）酶解：加2 mL 水，再加1 mol/L HCl 溶液100 μL，调节溶液pH 值在2～3 之间，加10 μL 50 mg/mL胃蛋白酶，37 ℃反应2 h，100 ℃加热15 min，加1 mol/L NaOH 溶液100 μL，冷却后，80 ℃加热10 min，15 ℃，6 000 r/min 离心20 min，取上清提取液于-80 ℃冷冻。（3）醇提：加2 mL 无水乙醇，80 ℃加热10 min，15 ℃，6 000 r/min 离心20 min，取上清液减压浓缩至干，加入同体积10%乙醇复溶。将提取液-80 ℃冷冻。3 种提取物，终体积定容为2 mL。

1.3.2 醇沉物酶解提取物和上清液制备 取5 g蔬菜和水果，以1∶5（m/V）的比例与水均质，4 ℃10 000 r/min 离心20 min，取上清液5 mL，加5mL无水乙醇，4 ℃下静置过夜，同等条件下离心，分离上清与沉淀。（1）取上清液5 mL，减压浓缩至干，加入5 mL 超纯水溶解。（2）取沉淀，加5 mL 水，取少量溶液测定蛋白浓度。另取500 μL 蛋白溶液加10 μL 1 mol/L HCl 调pH 值至酸性，摇均后加10 μL 50 mg/mL 胃蛋白酶溶液，37 ℃下反应2 h，沸水煮沸15 min，最后加10 μL 1 mol/L NaOH 中和HCl。

1.3.3 复配 将不同新鲜原料醇沉和非沉淀部分复配，复配方法见表1。“1”代表参与复配，“0”代表不参与复配，提取液各100 μL，混均，对照为超纯水。复配组中（除组2 外）各样品的剂量为原来的1/3，组2 的剂量为原来的1/2，试验重复3 次。

表1 不同组间的复配Table 1 Combination between different groups

1.3.4 体外模拟消化试验 胃蛋白酶-胰蛋白酶消化水解实验参考Garrett D A 等[21]。蔬菜水提物醇沉蛋白用50 mL 水溶解，用100 μL 1 mol/L HCl 调节pH 值至1.5，加入胃蛋白酶（E/S 1∶100，m/m），在37 ℃下搅拌反应2 h，沸水浴10 min，缓慢加100 μL 1 mol/L NaOH 调节pH 值至8，然后加入胰蛋白酶（E/S 1∶50，m/m），在37 ℃下搅拌反应3 h，沸水浴煮沸10 min 灭酶，冷却后2 000 r/min 离心10 min，取上清液。

1.4 试验测定

1.4.1 含水量 新鲜样品称重，置100 ℃烘箱中烘至恒重，称重，计算含水量。

1.4.2 蛋白质[22]吸取1.0 mL 样品提取液，稀释10 倍，加入5 mL 考马斯亮蓝溶液混均，避光静置2 min，测定其在595 nm 处的吸光值，重复3 次。

1.4.3 ACE 酶活性抑制效果[23]取50 μL pH8.3的0.1 mol/L 硼酸缓冲液与不同提取液50 μL 混合（相当于1.25 mg 原料干物质），加入160 μL 置于37 ℃下加热10 min 的2 mg/mL ACE 酶液和40 μL 5 mmoL/L HHL 溶液，于37 ℃下反应15 min。加入150 μL 1 mol/L HCl 终止反应。用0.45 μm滤膜过滤，HPLC 方法测定马尿酸的含量。水提取液的对照为超纯水50 μL，乙醇提取液的对照为10%乙醇50 μL，酶解提取液的对照为0.25 mg/mL胃蛋白酶液沸水浴的50 μL 溶液，分别加入反应体系中。

色谱条件：Hypersil ODS2 C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 um）；流动相：甲醇-超纯水体积比为15∶85，超纯水中含有0.1%的三氟乙酸（TFA）；柱温箱温度：30 ℃；进样量：20 μL；流速：1.0 mL/min；检测波长：228 nm。3 次重复试验。

取质量浓度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μg/μL 的马尿酸标准液，通过HPLC 方法测定马尿酸的含量及其对应的峰面积之间的关系，绘制标准曲线（图1）。曲线方程式为：y=6×107x + 109179，R2=0.9999，线性关系良好。检测范围：0.01～0.1 μg/μL。

ACE 酶活单位的定义：在37 ℃下，每1 min催化生成1 μmoL 马尿酸所需的酶量（U）。

1.5 数据处理

本试验数据为平均值±标准偏差（Mean±SD），采用Microsoft Excel 2010 处理数据，组间比较采用单因素方差分析 （one-way ANOVA analysis），P<0.05 具有显著性差异。

2 试验结果

2.1 水果和蔬菜提取物对ACE 酶的抑制

不同蔬菜和水果含水量、蛋白质含量会有差异。基于鲜重比较不同果蔬抑制ACE 能力，比较直观；基于干重比较不同果蔬抑制ACE 能力比较科学；基于蛋白质质量比较抑制ACE 能力，有利于发现哪种蛋白质产生ACE 的高效抑制肽。平菇含水量最高为94.23%，大蒜含水量最少为65.24%，其它3 种果蔬含水量88.36%～92.9%。平菇、西兰花以鲜重为基数的蛋白质含量较少，分别为3.83 mg/g 和4.13 mg/g，而菠菜、猕猴桃、大蒜含量较高，均在6.19 mg/g 以上。以干重为基础，大蒜蛋白质含量最低，为17.81 mg/g；菠菜的蛋白质最高，为90.11 mg/g；平菇的蛋白质含量不低，为66.31 mg/g。

表2 5 种果蔬的含水量及蛋白含量Table 2 Water and protein contents of 5 kinds of fruits and vegetables

表3 蔬菜和水果提取液对ACE 的抑制率Table 3 Inhibition percent rate of ACE by vegetable extract

大蒜、菠菜、西兰花、平菇水提取物对ACE 抑制率分别为26.28%，31.88%，87.00%，85.02%。而其水提蛋白酶解产物对ACE 抑制率分别为76.62%，99.43%，97.16%，63.09%。说明大蒜、菠菜主要是多肽抑制ACE 活性，西兰花和平菇主要是水溶性物质抑制ACE 活性。由于水提物质并没有从蛋白酶酶解物质中分离出，因此平菇的酶解物抑制ACE 活性低于水提取物。也因此认为平菇多肽没有抑制ACE 活性，反而减少了平菇水提物对ACE 的抑制。西兰花的多肽也有较强的抑制ACE效果。4 种蔬菜的乙醇提取物都促进ACE 活性，而菠菜和平菇乙醇提取物促进作用很弱，西兰花和大蒜乙醇提取物促进作用稍强。猕猴桃水提物和蛋白酶解物抑制ACE 酶活力，抑制率分别为73.99%和75.98%。这说明抑制物质并非多肽，而是水溶性物质。猕猴桃的醇提物促进ACE 活性，提高ACE 活性24.08%。

2.2 水果和蔬菜的多肽和非多肽物质对ACE 酶的抑制效果

猕猴桃蛋白酶解提取物促进ACE 活性。而西兰花、菠菜、大蒜的蛋白质酶解提取物都抑制ACE活性。以鲜重计和蛋白质质量计，西兰花酶解提取物抑制ACE 效果最好，说明西兰花多肽抑制ACE能力最强。基于干重计，菠菜酶解提取物抑制ACE效果最强。平菇的蛋白酶解物抑制ACE 效果不好，因此不进行蛋白质酶解醇沉试验，而是进行平菇水提上清液对ACE 的抑制试验。

猕猴桃和平菇的非蛋白酶解水提物都有很强的抑制ACE 活性，西兰花水提物抑制ACE 效果很弱，说明在4 ℃过夜沉淀期间，西兰花水提物中抑制ACE 的物质可能降解了。基于鲜重，猕猴桃抑制ACE 效果强于平菇，而基于干重，平菇抑制ACE 活性强于猕猴桃。

表4 蛋白酶解的乙醇沉淀物对ACE 的抑制作用Table 4 Inhibition of ACE by pepsin hydrolysate of ethanol precipitation protein

表5 乙醇沉淀的上清液非蛋白部分对ACE 的抑制强度Table 5 Inhibition intensity of ACE by non-protein fraction in ethanol precipitation supernatant

2.3 5 种水果蔬菜复配对ACE 的抑制效果

果蔬提取物抑制ACE 酶所用的果蔬剂量相当于新鲜原料稀释600 倍（醇沉酶解组）和1 200倍（醇沉上清液组）。用HPLC 在波长228 nm 处检测马尿酸含量的变化，发现没有出现干扰峰，说明各复配组没有受到样品成分的明显干扰。另外，样品经高倍数稀释后，对ACE 还有很高的抑制活性，说明摄入少量果蔬可能影响ACE 酶的活性（见图1）。

图1 复配组HPLC 出峰图Fig.1 HPLC peak map of mixing groups

表6 果蔬不同复配组对ACE 抑制百分率Table 6 Inhibition percent rate of ACE by different mixing groups

水提物组具有较高抑制ACE 活性的猕猴桃和平菇，与酶解组具有较高活性的西兰花、大蒜和菠菜复配后抑制ACE 效果显示：西兰花、大蒜和菠菜3 种酶解复配后，具有最高的ACE 抑制百分率为64.61%，其次为猕猴桃水提物、平菇水提物和菠菜酶解物的复配组，对ACE 抑制百分率为59.62%，都高于3 种蔬菜各自酶解提取物的抑制效果，说明存在增效作用。而其它复配组的抑制ACE 效果受到削弱，说明猕猴桃和平菇的水提物与大蒜、西兰花的酶解物混合用于抑制ACE 时，存在拮抗现象。

2.4 3 种蔬菜酶解产物体外模拟消化后对ACE的抑制效果

西兰花、大蒜和菠菜的醇沉物质经胃蛋白酶消化后的活力较强，其成分很可能是多肽。其在体内，还要经过胰蛋白酶的消化，如口服则有可能失活。与未经模拟消化的单一胃蛋白酶酶解后的提取物对ACE 抑制率相比，西兰花、大蒜和菠菜3种蔬菜的酶解物经模拟消化，抑制ACE 活性还很高。消化试验抑制ACE 酶的剂量相当于原料稀释了6 000 倍。西兰花保留的ACE 抑制率最高，为52.05%；大蒜次之，为45.03%；菠菜抑制率最低，为37.09%，见表6。3 种蔬菜经模拟消化后物质对ACE 的抑制强度显著高于胃蛋白酶处理，见表3。而其浓度只有后者的1/10，说明其它未被胃蛋白酶充分降解的多肽，经模拟消化后进一步降解，产生新的抑制ACE 的多肽。同时也说明原有的多肽抗胰蛋白酶消化。

表7 体外模拟消化多肽对ACE 的抑制率Table 7 Inhibition percent rate of ACE by polypeptide in vitro simulated digestion

3 结论

5 种果蔬的水提物和胃蛋白酶水解物抑制ACE 活性，而乙醇提取物促进ACE 活性。猕猴桃和平菇的水提物抑制ACE 活性，两者的多肽对ACE 的影响小。大蒜、菠菜抑制ACE 活性的主要物质是多肽。西兰花的水提物和多肽都强烈抑制ACE 活性，然而，西兰花水提取物抑制ACE 的物质容易降解。西兰花多肽抑制ACE 能力最强。

西兰花、大蒜和菠菜3 种酶解物复配具有增效作用。猕猴桃和平菇水提物与菠菜酶解物复配，也存在增效作用。然而，猕猴桃和平菇的水提物与大蒜、西兰花的酶解物之间存在拮抗现象。

西兰花、大蒜和菠菜的多肽经模拟消化后，活性有较大的下降，然而仍有较高的ACE 抑制活性。西兰花保留的ACE 抑制率最高，大蒜次之，菠菜抑制率最低。