阿胶对丙烯酰胺诱导的斑马鱼胚胎氧化应激损伤的保护作用

曹菲薇 汝文文 和娴娴 高登锋 陈艺煊 常 成 王东亮* 朱加进*

（1 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州310058 2 国家胶类中药工程技术研究中心 东阿阿胶股份有限公司 山东聊城252201 3 浙江大学动物科学学院 杭州310058）

丙烯酰胺（Acrylamide，AA）是一种白色、无嗅的晶体物质，其聚合物——聚丙烯酰胺在工业生产和生物研究中被广泛应用[1]。研究表明，含淀粉类的食品经高温加工（≥120 ℃）会产生丙烯酰胺，尤其在各种油炸和烤制食品中普遍存在[2]。由于丙烯酰胺极易溶于水，且分子质量较低，因此容易通过呼吸道、皮肤和消化途径等进入动物和人体。Zhang 等[3]曾在乳汁和胎盘中发现丙烯酰胺。丙烯酰胺具有神经毒性、遗传毒性、生殖毒性及潜在的致癌性，被国际癌症研究中心列为2A 类致癌物[4]。研究表明，丙烯酰胺引起的神经毒性可能是因机体氧化与抗氧化之间的平衡受到破坏而引起的，而这种破坏往往是由活性氧（ROS）和脂质过氧化过度造成的[5]。Chen 等[6]研究发现Caco-2 细胞在AA 作用下孵化时加速了24 h 内产生的ROS 且降低了细胞活性。探索减少AA 导致氧化应激损伤的方法成为研究热点。为实现这一目的，研究人员主要从两方面入手，一方面，减少食品加工过程中AA 的产生。国内外已有许多研究人员在加工工艺和抑制剂两个方向上进行探究，例如Santina Romani 等[8]研究发现油炸温度相同时，油炸时间越长AA 生成量越多；Jung 等[9]研究发现经柠檬酸处理过的油炸、烘烤玉米片AA 含量分别下降了82.2%和72.8%。另一方面，抑制已产生的AA 对机体造成的危害。目前研究人员主要从植物提取物和营养素方向进行研究。例如，Jiang 等[10]研究发现AA 能使IEC-6 细胞ROS 活性升高，抗氧化酶活性减弱，而灵芝多糖预处理能显著抑制ROS 产生，提高抗氧化酶活性。Hamdy 等[11]用AA 处理雌性大鼠，结果SOD、CAT、GSH-Px 显著降低，用橙皮素处理后，抗氧化酶活性显著上升（P＜0.001）。Rasha 等[12]用AA 饲喂白化病大鼠，持续40 d，实验结束后发现AA 组MDA 显著上升，且舌骨骼肌有明显的损伤。而用维生素E 与AA 共同饲喂的大鼠则能改善以上现象，且时间越长，改善效果越好。目前关于动物性食品对丙烯酰胺毒性抑制作用的研究还十分少见。

阿胶（Colla corii asini，CCA） 为马科动物驴（Equus asinus L．） 的干燥皮或鲜皮制成的固体胶，与人参、鹿茸并称为“滋补三宝”。阿胶的化学成分主要是皮胶原、多糖、挥发性物质和无机物质等[13]，具有补血、抗凝、镇静和提高免疫等功效。Wang 等[14]发现阿胶可以通过增强SOD、CAT 和GSH-Px 的活性以及抑制MDA 的生成来延缓老年小鼠的衰老过程。斑马鱼 （Danio rerio，Zebrafish） 是近年备受关注的模式生物，具有个体小，发育周期较短，产卵量大，胚胎透明，易于观察等特点[15]，且与人类基因相似度超过80%等优点[16]，也因此斑马鱼常被用于药理学、毒理学和发育学等方向的研究。Zhang 等[17]以斑马鱼为动物模型，研究丙烯酰胺导致的氧化应激损伤，研究发现2 mmol/L AA 处理后斑马鱼胚胎显示出ROS 含量显著升高，GSH 含量、SOD 和GST 活力显著降低等氧化应激现象。

本文从丙烯酰胺导致斑马鱼胚胎氧化应激损伤的现象入手，研究动物性食品阿胶的抗氧化性能及其机理，为阿胶的开发利用提供理论基础，为防御丙烯酰胺危害提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

斑马鱼胚胎培养液 （0.05%海盐和0.002%亚甲蓝），由纯净水、海盐与亚甲基蓝制备而成。

阿胶，由山东东阿阿胶股份有限公司提供。将阿胶粉碎，取1.25 g 阿胶粉末与500 mL 胚胎培养液混合，制备2.5 mg/mL 的母液，备用。试验时将阿胶母液用培养液稀释为0.01，0.05，0.10，0.50，1.00 mg/mL 和2.50 mg/mL 的工作液。

丙烯酰胺（纯度≥99.9%），阿拉丁试剂公司；活性氧 （ROS） 测定试剂盒E004、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒A007-1-1、丙二醛（MDA）测定试剂盒A003-1、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒A001-3、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒A005、总蛋白定量测定试剂盒A045-2，南京建成生物工程研究所；反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq II 试剂盒，大连TAKARA 生物技术公司；其余化学试剂均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 斑马鱼的饲养与胚胎收集

所有动物实验完全按照《浙江省实验动物使用条例》执行，且获得了浙江大学医学院动物伦理委员会的批准（伦理规范许可号：ZJU2018-3-24-009Y）。将斑马鱼养殖在独立养鱼系统中，水温控制在（28±0.5）℃，光周期14 h（光）：10 h（暗），每天饲喂2 次丰年虫幼虫。

胚胎收集方法：提前一晚将成年斑马鱼按照雌、雄比2∶1 的比例装入交配盒中，并用隔板将雌、雄鱼分开，第2 天早上光照1 h 后移去隔板。1 h 后，挑选发育正常的胚胎，用胚胎培养液轻轻漂洗，备用。

1.3 斑马鱼胚胎暴露实验

1.3.1 CCA 对斑马鱼胚胎存活率的影响 从7～9 hpf 开始，将560 颗胚胎随机分成7 组，转移到48孔板中，每个孔1 个胚胎且均加入1 mL 胚胎水，其中CCA 质量浓度分别为0，0.01，0.05，0.10，0.50，1.00 mg/mL 和2.50 mg/mL，然后，分别在24，48，72，96 hpf 和120 hpf 时记录胚胎的存活率，以确定CCA 的最佳培养浓度。

1.3.2 CCA 对丙烯酰胺诱导的斑马鱼氧化应激损伤的保护作用 将胚胎随机分成5 组，其中一个为对照组（胚胎培养液），一个丙烯酰胺（AA）组，另外3 个为低、中、高浓度的阿胶处理组（0.05，0.10 mg/mL 和0.50 mg/mL），每组3 个平行，每个平行90 个胚胎。

具体暴露过程是：如图1所示，对照组：用胚胎培养液培养至72 hpf；AA 组及CCA 组：取7～9 hpf 斑马鱼于含有不同CCA 质量浓度（0，0.05，0.10 mg/mL 和0.50 mg/mL）的胚胎培养液中培养。处理1 h 后，将胚胎分别加入同时含有3 mmol/L丙烯酰胺以及相应阿胶质量浓度（0，0.05，0.10 mg/mL 和0.50 mg/mL）的胚胎培养液中，直到24 hpf。取出胚胎，用胚胎培养液轻轻漂洗，并用胚胎培养液培养至72 hpf。

在本次实验中，PMs 和PWMs 2种方法共同表明了年平均流量呈单元尺度性，且平均尺度因子为1.158。

图1 斑马鱼胚胎暴露流程图Fig.1 Flow chart of the exposure of zebrafish embryos

1.4 胚胎活性氧（ROS）含量测定与荧光图像分析

参照Gerber 等[19]的研究，采用活性氧荧光探针DCFH-DA 方法检测斑马鱼胚胎总体活性氧水平。将72 hpf 胚胎用胚胎培养液清洗3 次，每组取24 个胚胎转移至96 孔板中，加入含有10 μmol/L DCFH-DA 的胚胎培养液250 μL，28.5 ℃避光孵育30 min；随后用不含DCFH-DA 的胚胎培养液漂洗胚胎3 次，转移至96 孔黑色酶标板中，每组取10 个胚胎用多功能酶标仪检测荧光强度，另取10 颗胚胎用配有彩色数码相机的荧光显微镜（奥林巴斯，日本）观察拍摄斑马鱼图像。

1.5 氧化应激相关生化指标检测

斑马鱼胚胎培养72h 后，用PBS 漂洗胚胎，再根据试剂盒说明书，用0.86%的生理盐水在冰上制备得到质量分数为10%的斑马鱼组织匀浆液，离心，取上清，测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力、丙二醛（MDA）和总蛋白（TP）含量。

1.6 氧化应激相关基因表达水平测定

参照Shin 等[20]的研究，首先使用TRIzol 试剂将总RNA 提取出来，然后用微量核酸测定仪（NanoDrop 1000） 在波长260 nm 处估算总RNA浓度，且通过A260nm/A280nm比率评估RNA 的质量。

样品总RNA 经反转录得到cDNA，目标基因引物由大连TAKARA 公司合成（表1）。qRT-PCR程序：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃45 s，55 ℃10 s。基因表达的差异倍数通过2-ΔΔCt方法计算，对每个浓度组设置3 个生物学重复。

1.7 统计分析

使用SPSS20.0，以单因素方差分析和Turkey’s 多因素t 检验进行比较，并进行one-way ANOVA 数据分析。P＜0.05 为统计显著，所有结果表示方法均为平均值±标准差（SD）。

表1 实时定量PCR 反应引物序列Table 1 Sequences of primers for RT-qPCR amplification

2 结果与分析

2.1 CCA 浓度对斑马鱼胚胎存活率的影响

参考Cai 等[21]的研究，探究适合的斑马鱼胚胎的CCA 浓度。用不同浓度CCA 处理斑马鱼胚胎并培养至120 hpf，每隔24 h 记录存活率。由表2可知，当CCA 质量浓度在0.01～0.5 mg/mL 之间时，斑马鱼胚胎的存活率没有明显差异，而当CCA质量浓度大于1 mg/mL 时，存活率显著下降（P＜0.001）。最终选择0.05，0.10 mg/mL 和0.50 mg/mL的阿胶溶液做下一步实验。

2.2 CCA 对斑马鱼胚胎氧化应激的保护作用

2.2.1 斑马鱼胚胎存活率 由图2可知，将胚胎用AA 处理后，24，48 hpf 和72 hpf 的存活率较对照组降至（80±3.74）%，（78.33±2.87）%和（78±3.27）%（P＜0.01）。与CCA 共同处理后，胚胎存活率明显提高，呈剂量依赖性，如0.50 mg/mL CCA处理的胚胎存活率显著提高（P＜0.05）。

表2 不同浓度阿胶溶液处理后斑马鱼胚胎的存活率（%）Table 2 The survival rate （%） of zebrafish embryos in different concentrations of CCA

图2 CCA 对AA 暴露诱导的斑马鱼胚胎氧化应激损伤的存活率的影响Fig.2 Effect of CCA on survival rates of AA-induced oxidative stress zebrafish embryos

2.2.2 斑马鱼胚胎活性氧含量 用荧光探针DCF检测细胞内ROS 生成水平，评价CCA 是否对AA产生的氧化应激损伤起到保护作用[22]。由图3A 可知，AA 诱导的ROS 含量比对照组增加约1.11 倍（P＜0.01），与CCA 共同处理后ROS 含量显著降低，且呈剂量依赖性。当CCA 质量浓度达到0.5 mg/mL 时，与AA 组比，ROS 水平降低了9.31%（P＜0.01）。由图3B 的荧光图像可知，AA 组与对照组相比荧光强度显著增强，而CCA 预处理的斑马鱼胚胎ROS 强度明显降低。这说明CCA 可有效抑制ROS 的产生。

图3 CCA 对AA 暴露诱导的斑马鱼胚胎氧化应激的活性氧自由基（ROS）的清除作用Fig.3 Effect of CCA on ROS levels in AA-induced oxidative stress in zebrafish embryos

2.2.3 斑马鱼胚胎抗氧化相关生化指标 为了进一步探讨CCA 的保护作用机制，测定斑马鱼胚胎抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT 活性。如图4a 和4b所示，与对照组相比，单独暴露于浓度3 mmol/L的AA 组，斑马鱼胚胎的SOD 和GSH-Px 活性显著降低 （分别降低了59%和25%，P＜0.01 和P＜0.05）。用0.5 mg/mL CCA 处理的斑马鱼胚胎，SOD 和GSH-Px 活性显著升高，分别提高了94.52%和32.05%（P＜0.05）。如图4c 所示，与对照组相比，AA 组显著降低CAT 含量（P＜0.01）。斑马鱼胚胎经0.10 mg/mL 和0.50 mg/mL CCA 处理后，CAT 含量比AA 组分别增加了96%和117%（P＜0.01 和P＜0.001）。如图4d 所示，与对照组相比，AA 处理增加了244%的MDA 含量（P＜0.01），而当斑马鱼胚胎预先暴露于不同浓度的CCA 时，MDA 含量降低了41.33%（P＜0.05）。

图4 CCA 对AA 暴露诱导的斑马鱼胚胎氧化应激的抗氧化指标的影响Fig.4 Effect of the CCA on AA-induced antioxidant indictors in AA-induced oxidative stress zebrafish embryos

2.3 氧化应激相关基因相对表达量

如图5所示，与对照组相比，AA 显著降低Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、GPX1 和keap1 的表达水平（P＜0.05），提高了Nrf2、HO-1、NQO1 的表达水平（P＜0.001）。CCA 处理后，Nrf2 及其调控的基 因HO-1、NQO1、GPX1、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和CAT 基因表达水平进一步上调，而keap1 显著下降。与AA 组相比，高浓度CCA 组胚胎抗氧化基因Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、GPX1、Nrf2、HO-1、NQO1 的表达水平分别上调了21.06%，19.98%，38.27%，93.01%，46.23%，35.12%，137.19%（P＜0.05），keap1 的表达水平则下调了54.24%（P＜0.05）。试验结果表明，3 mmol/L AA 可诱导斑马鱼胚胎发生氧化应激，Nrf2-keap1/ARE 通路被激活，机体内Nrf2 基因和下游的NQO1、HO-1 基因表达量均显著升高，keap1 基因显著降低，从而提高抗氧化能力，以减轻氧化应激带来的损伤。试验结果显示，AA 处理后，抗氧化酶对应的基因Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT 和GPX1 显著下降，与抗氧化酶的变化趋势一致，而与Nrf2 基因的变化趋势相反。与AA 组相比，阿胶处理进一步增强了Nrf2及其下游抗氧化酶基因和II 相解毒酶基因的表达水平，从而有效增强了机体的抗氧化能力，实现对机体的保护作用。

图5 CCA 对氧化应激斑马鱼胚胎的抗氧化相关基因表达水平的影响Fig.5 Effect of CCA on the mRNA expression of antioxidant related genes in AA-induced oxidative stress in zebrafish embryo shown in pictures

3 讨论

众所周知，AA 具有较强的神经毒性、发育毒性和心脏损伤作用等，对人体健康造成危害。Alturfan 等[5]指出，AA 通过破坏机体氧化损伤和抗氧化损伤的防御平衡体系，产生过量自由基。此外，Gedik 等[23]和Ince 等[24]发现，随着氧化应激水平的升高，MDA 的含量会有所增加。本研究中，AA 处理导致斑马鱼胚胎ROS 和MDA 含量均显著升高，这一结果与Huang 等[25]的研究结果一致。Hassan 等[27]、Prasad 等[28]和Sour 等[29]研 究表 明，除了MDA 含量升高，AA 导致的氧化应激还表现在抑制抗氧化酶的活性，包括SOD、CAT 和GSHPx。Catalgol 等[30]指出，SOD 能清除机体超氧阴离子，CAT 可以直接催化H2O2还原为对机体无害的H2O 和O2。GSH-Px 在AA 诱导产生的ROS 解毒过程中起到重要作用[7]。本研究中，AA 组SOD、CAT 和GSH-Px 的活力均显著下降，这表明AA可能通过抑制抗氧化酶活性，进一步加剧了脂质过氧化的作用，使MDA 和ROS 含量的升高。为探究抗氧化酶与其对应基因的水平是否一致，用实时定量PCR 对抗氧化酶相关基因水平进行测定。AA 组处理后的斑马鱼胚胎Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT 和GPX1 基因的表达水平显著降低，与SOD、CAT 和GSH-Px 活性下降一致。由此可知，AA 通过降低抗氧化酶相关基因的表达，抑制了抗氧化酶的活性。

Ma[31]和Tanaka 等[32]指出细胞抵御氧化应激的主要机制是激活kelch 样ECH 关联蛋白1-转录因子NF-E2 相关因子/抗氧化应激原件[Kelchlike ECH-associated protein 1（Keap1）-Nrf2 （nuclear factor E2-related factor 2）/ARE （antioxidant response element）]信号通路，该信号通路控制了与ROS 产生有关蛋白的基因的表达。Ma[31]和Liu 等[33]发现在正常生理条件下，Nrf2 与Keap1 在细胞质中相结合。Hybertson 等[34]指出当受到亲电子物质或其它氧化物质刺激时，Nrf2 与Keap1 解偶联并进入细胞核，与ARE 结合，启动控制抗氧化酶如SOD 的基因表达。本研究中，与对照组相比，AA 可上调Nrf2、HO-1、NQO1 基因表达水平，并下调keap1 基因的表达水平，这一结果表明AA可激活Nrf2 及其下游HO-1、NQO1 基因的转录活性。

Ramos 等[37]研究发现，ROS 的过量产生会导致细胞氧化还原紊乱，而抗氧化剂的补充通过减少ROS 来显著调节细胞氧化应激水平。Chen 等[38]在研究黑莓消化产物对AA 诱导的氧化应激保护作用试验中，发现黑莓消化物预处理后Caco-2 细胞产生的ROS 是AA 组的（56.6±2.9）%。Jiang 等[39]用IEC-6 细胞探究灵芝多糖对AA 诱导的氧化损伤的保护作用，研究发现，灵芝多糖处理组与AA组相比，SOD 活性提高了103.56%，GSH-Px 活性也有显著提高，而MDA 和ROS 含量则显著降低。本研究中，与AA 组相比，CCA 和AA 共同处理的斑马鱼胚胎ROS 和MDA 含量分别降至10.05%和41.33%，SOD 活性提高了94.52%，CAT 和GSH-Px 的活性也都显著提高。CCA 组胚胎中，与抗氧化酶对应的Mn-SOD、Cu/Zn-SOD 和CAT 基因表达水平均显著升高，即与酶活性一致。Akino等[40]发现在人颗粒细胞中，激活Nrf2 可提高Cu/Zn-SOD、CAT、ogg1 等基因的表达水平，从而降低氧化应激水平。与AA 组相比，CCA 处理过的斑马鱼胚胎Nrf2 基因水平显著升高。结合MDA 和ROS 的结果推测：AA 对Nrf2 的激活可能是AA在体内产生大量的ROS 后所激活引起的。试验数据还显示，与AA 组相比，阿胶的预处理能使Nrf2基因表达水平进一步提高，表明阿胶可改善Nrf2的转录活性，激活下游抗氧化酶和II 相解毒酶的转录，增加细胞内抗氧化物质，从而对机体起到保护作用。

Cong 等[41]研究指出，SOD、CAT 和GSH-Px 也是Nrf2 调控的下游抗氧化酶，受到激活的Nrf2 能够启动调控Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、GPX1 基因的转录表达，从而增强机体抗氧化酶含量。然而，本研究结果显示，AA 处理后抗氧化酶及其基因表达水平均显著下降，而非上升。这一结果与2019年Cui 等[42]对杜鹃素的氧化应激调节作用的研究结果类似。这可能与以下两个方面有关：一是AA 能够直接作用于调控抗氧化酶的基因，抑制其进行转录表达；二是AA 导致Nrf2 上调，Nrf2 也启动了下游SOD、CAT 和GSH-Px 对应基因的表达，而该程度远弱于AA 对抗氧化酶基因直接的抑制作用，因此，最终呈现出AA 作用后Nrf2 上调，SOD、CAT 和GSH-Px 对应的基因不增反降的结果。

综上所述，阿胶能提高抗氧化能力，抑制丙烯酰胺诱导的斑马鱼胚胎脂质过氧化物的生成，对丙烯酰胺诱导的斑马鱼胚胎氧化应激损伤具有保护作用。