顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法检测茶叶中雪松醇

蔡普默，朱雪芬，查雯雯，马春华

（武夷学院茶与食品学院，福建武夷山354300）

茶是一类健康的非酒精饮料，因其芳香风味和具有多种保健功效而广受欢迎[1]，仅2017年全球茶叶消费总量达544万吨[2]。茶在我国已有数千年历史，以其加工工艺来区分，可分为白茶、黑茶、绿茶、红茶、乌龙茶和黄茶，而不同的茶有着各自独特的韵味和香气特征[3]。现阶段，已从各类茶叶中分离出700余种挥发性成分，主要含括酯类、醛类、醇类、酮类、杂环类等[4]。其中，雪松醇又名柏木醇、柏木脑，分子式为C15H26O，属于倍半萜醇[5]，具有温和的杉木芳香和持久的柏木香，是茶叶木香香型的重要“呈香”物质之一[6]。

香气是茶叶的灵魂，是茶叶品质优劣的一个重要感官评价因素，决定茶叶等级的评判和价格的制定，影响消费者对茶叶的喜好程度[7]。茶叶香气的提取完整度，很大程度上决定了茶叶挥发性成分的后续检测与分析，其有效提取有助于确认茶叶呈香物质、研究香气性能及揭示茶叶香气形成机制等[8]。目前，茶叶香气的常规检测方法是气相色谱和质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[9]，样品前处理的方法有多种，如有机溶剂萃取法、同时蒸馏萃取（simultaneous distillation and solvent extraction，SDE）[10]、水蒸气蒸馏（steam distillation，SD）[11]、超临界 CO2流体萃 取 （supercritical CO2fluid extraction，SFE-CO2）[12]、液-液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）[13]、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）[14]、固相萃取（solid phase extraction，SPE）[15]、减压蒸馏萃取法（vacuum distillation extraction，VDE）[10]、顶空吸附法（headspace analysis，HSA）[16]及溶剂辅助风味蒸发法（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）[17]等。

SPME法是一种无溶剂、环境友好型，集合萃取、浓缩和解吸于一体的样品分析前处理技术，其在相对温和条件下进行萃取，避免破坏化合物，与其他萃取方法相比，因具操作简单、设备要求低、灵敏度高、无溶剂干扰的优点而备受关注[14]，该方法目前在萃取茶汤香气和茶叶干茶香的应用上较广[18]。由此可见，SPME和GC-MS技术的联用，将有助于提高分离、定性及定量分析茶叶香气成分的水平。李云飞等[4]曾通过优化SPME萃取条件，并与GC-MS联用，建立一套茶叶香气物质——香叶醇的分析测定方法。

本研究以茶叶为研究对象，对萃取纤维类型、萃取温度、萃取时间及搅拌速度等萃取参数进行优化，建立雪松醇的GC-MS分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

武夷红茶大红袍样品：市售；雪松醇（分析纯）、癸酸乙酯（分析纯）：美国Sigama Aldrich公司；乙醇：国药集团化学试剂有限公司。

7890A-5975C型气质联用仪：美国Agilent公司；RCT磁力搅拌器：德国IKA公司；ME55/02分析天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；50/30 μm DVB/微分子筛（Carboxen）/PDMS（DVB/CAR/PDMS）、100 μm PDMS、PA、PDMS/DVB、固相微萃取手柄：美国 Supelco公司；HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×250 μm×0.25μm）：美国Agilent Scientific公司。萃取纤维使用前需根据说明书对萃取纤维进行老化。

雪松醇标准溶液的配制：准确称取一定量的雪松醇标准品用无水乙醇溶解，配制为浓度1.0 mg/mL的储备液，再用水稀释成一系列浓度的工作液，储存于4℃冰箱备用。

基底样品的制备：将10 g的岩茶叶样品置于烧杯中，加入75%乙醇溶液浸泡30 min后，洗净乙醇，用沸水浸泡30 min，多次重复，直至样品检测不到雪松醇，烘干、粉碎，过40目筛备用。

1.2 方法

1.2.1 固相微萃取

将50 mm的磁子放入装有5 mL标准品或样品萃取液的顶空瓶中，盖上带有聚四氟乙烯隔垫的盖子，将顶空瓶放在磁力搅拌器上水浴加热；将萃取头插入样品瓶中，采用顶空萃取的方式，吸附一段时间，萃取结束后进样，于250℃解析5 min。

1.2.2 GC-MS条件

GC条件：HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×250 μm×0.25μm）；不分流进样模式，进样口温度250℃，载气为高纯氦气（纯度＞99.999%），流速1.0 mL/min；柱流量控制模式：恒压，49.62 kPa；色谱柱升温程序：柱温初始60℃，保持3 min，以3℃/min速率升温至120℃，保持1 min，再以4℃/min升温至200℃，保持1 min，最后以5℃/min升温至240℃，保持1 min。

MS条件：离子源为电子轰击离子源（electron ionization，EI），电离电压为70 eV，选择全离子扫描模式，离子源温度230℃，四极杆温度为150℃，接口温度250℃，辅助加热器温度为250℃；溶剂延迟3.0 min。

1.2.3 顶空固相微萃取条件的优化

茶叶中的香气成分雪松醇，受热后易挥发，能通过顶空固相微萃取技术高效提取[19]。然而固相微萃取是一个动态平衡的过程，在应用过程中受诸多因素影响，主要有萃取纤维、待测物浓度、萃取时间、萃取温度及搅拌速度等，因此优化最适宜的萃取条件显得十分必要[20]。

萃取纤维：选取 50/30 μm DVB/CAR/PDMS、100 μm PDMS、PA和PDMS/DVB 4种萃取纤维；萃取时间：选取 10、20、30、40、50 min；萃取温度：设置 65、70、75、80、85℃的温度梯度；搅拌速度：设定200、300、400、500、600 r/min的搅拌速度。优化时固定其他条件，以某一个萃取条件为变量，通过测定不同条件下的目标物峰面积，比较不同萃取条件对萃取雪松醇效率的影响。

1.2.4 方法评估

吸取20 μL不同浓度的雪松醇标准溶液加到装有0.05 g空白基质的顶空瓶中，同时加入内标溶液20 μL，在优化条件下进行萃取，后经GC-MS分析测定，以信噪比S/N=3时雪松醇的浓度作为仪器检出限（limit of detection，LOD）。

1.3 数据处理

所有样品测定的数据为3次重复测定数据的平均值。

2 结果与分析

2.1 顶空固相微萃取条件的优化

2.1.1 萃取纤维的选择

顶空固相微萃取是待测物在萃取纤维与待测样品之间的富集平衡过程，萃取纤维在一定程度上影响目标化合物的吸附量及平衡时间，通常与待测物的吸附率呈正相关，而与平衡时间呈负相关。依据“相似相容”原理，可以根据待测物的挥发性和极性，选取与待测物极性相似的萃取纤维材料，以提高方法精确度[21]，纤维对雪松醇萃取的影响见图1。

图1 纤维对雪松醇萃取的影响Fig.1 Effects of different fibers on the cedrol extraction

由图1可知，50/30 μm DVB/CAR/PDMS涂层的萃取纤维对雪松醇的萃取效率最高，后续的条件优化试验中选用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维。

2.1.2 萃取时间的优化

萃取时间是HS-SPME系统中的一个重要参数，受多种因素影响，该系统是待测物、样品顶空和萃取纤维之间的三相平衡，整个过程只要还未达平衡，待测液的初始浓度及萃取时间都会影响萃取纤维上待测物的含量[22]，萃取时间对雪松醇萃取量的影响见图2。

图2 萃取时间对雪松醇萃取量的影响Fig.2 Effects of extraction time on the cedrol extraction

如图2所示，雪松醇萃取效率随着时间的增加都呈现逐渐上升的趋势，在30 min时达到高峰，随着萃取时间的加长，萃取效率呈现下降的趋势或者基本保持恒定，因此本试验选取30 min。

2.1.3 萃取温度的优化

溶液温度的升高可以加速分子运动、提高分子运动的动能，加速待测物在各相之间的扩散，进而有利于萃取。但温度过高易使物质产生高温反应和解吸，因此在萃取过程中应确定适宜的萃取温度，以达到最佳萃取效果[20]。萃取温度对雪松醇萃取量的影响见图3。

图3 萃取温度对雪松醇萃取量的影响Fig.3 Effects of extraction temperatures on the cedrol extraction

从图3可以明显看出80℃时的萃取效率最高，因此选定80℃为后续试验的萃取温度。

2.1.4 搅拌速度的优化

待测物的扩散速度会随着搅拌速度的提高而加快，这有利于待测物与萃取纤维之间进行传质，最终使体系达到萃取平衡的时间缩短，搅拌速度对雪松醇萃取的影响见图4。

由图4可知，随着搅拌速度的增加，萃取效率先增大，在300 r/min时达到最大，之后随着搅拌速度的增加呈现下降的趋势。因此，本试验选择300 r/min。

2.2 方法评估

雪松醇检测的线性范围、相关系数及检测限见表1，基底加标和样品的色谱图见图5、图6。

图4 搅拌速度对雪松醇萃取的影响Fig.4 Effects of stirring speeds on the cedrol extraction

表1 雪松醇检测的线性范围、相关系数及检测限Table 1 Linear range，correlation coefficient and detection limit of cedrol detection

图5 茶叶基底加标雪松醇色谱图Fig.5 Chromatogram of cedrol in tea substrate

图6 茶叶样品色谱图Fig.6 Chromatogram of tea sample

如图5和图6所示，雪松醇的保留时间在16.1min，用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱的方法测雪松醇的含量，方法的线性范围在 1 μg/kg～200 μg/kg，检测限为0.1 μg/kg，相关标准偏差为4.5%。

2.3 样品分析

在最优萃取条件下，用该方法检测几种岩茶样品，标号为1～6，测定雪松醇的含量，结果见表2。

表2 茶叶样品中雪松醇含量分析Table 2 The content analysis of cedrol in tea samples

表2结果表明，这6种茶叶的雪松醇含量在7.26 μg/kg～28.34μg/kg之间，回收率在81.7%～107.6%，相对标准偏差在3.9%～6.2%之间。

3 结论

优化试验参数是提高检测灵敏度的重要手段，SPME-GC-MS是一种有效检测茶叶香气成分雪松醇的方法，通过探究SPME纤维、萃取温度、搅拌速度及萃取时间等因素，得到茶叶中雪松醇的固相微萃取条件的最优方案为：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取涂层的萃取纤维，在萃取温度为80℃、转速为300 r/min下萃取30 min。在此优化的萃取条件下，茶叶中雪松醇平均回收率在81.7%～107.6%之间，相对标准偏差是3.9%～6.2%，在 1 μg/kg～200 μg/kg范围内呈现良好的线性关系。本研究所建立的茶叶中雪松醇的HSSPME-GC-MS分析方法，具有快速、不需要溶剂、灵敏度高等特点，能满足茶叶中香气成分雪松醇的检测。