HPLC法测定儿童开胃乐中芥子碱硫氰酸盐含量

王欢欢，白 林，黄晓舞（中国人民解放军总医院制剂中心，北京 100853）

儿童开胃乐是解放军总医院非标准制剂品种，临床使用已经超过20余年，质量可靠，疗效安全。处方由山楂、鸡内金、麦芽、莱菔子等七味中药组成，适用于喂养不当引起的厌食，感冒引起的食欲不振等，服用后胃口好、体质壮、血色素提高。该制剂现行标准较低，没有含量测定项，为了更好的控制其内在质量，本研究采用HPLC法对儿童开胃乐中芥子碱硫氰酸盐含量进行测定，旨在更好地控制其质量。

1 仪器与材料

1.1 仪器

JA2003型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；MS205DU电子天平（梅特勒-托利多公司）；LC-2030C3D高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ-100DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 材料

儿童开胃乐（解放军总医院，批号：190701、190702、190703；规格：10 mL/支）；芥子碱硫氰酸盐对照品（北京曼哈格生物科技有限公司，批号：B0002909，纯度：93.1%）；莱菔子对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121074 - 201304）。甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为一级水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验[1]

色谱柱：苯基柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，上海月旭科技股份有限公司）；流动相：乙腈-3%冰醋酸水溶液（12∶88）为流动相；流速：1.0 mL·min-1；检测波长为326 nm；进样量：10 μL；理论塔板数按芥子碱硫氰酸盐峰计算应不低于5000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取芥子碱硫氰酸盐对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含15 μg的溶液，混匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密称取混合均匀的供试品2 g，置于50 mL容量瓶中，加70%甲醇30 mL，混匀，超声30 min，取出冷却至室温，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，转移至50 mL离心管中，8000 r·min-1离心5 min，取上清液，0.45 μm有机滤膜过滤，备用。

2.2.3 莱菔子对照药材溶液 取莱菔子对照药材细粉约0.5 g，按“2.2.2”项下方法制成莱菔子对照药材溶液。

2.2.4 阴性样品溶液 取缺少莱菔子药材的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制成阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

取上述对照品溶液、供试品溶液、莱菔子对照药材溶液及阴性样品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。结果显示，供试品中芥子碱硫氰酸盐与对照品及对照药材在相同保留时间处有相同色谱峰，峰形良好，与其他组分峰基线分离度较好，且阴性样品无干扰。

图1 高效液相色谱图A - 芥子碱硫氰酸盐对照品，B - 莱菔子药材，C - 供试品，D - 阴性对照；1 - 芥子碱硫氰酸盐Fig 1 HPLC chromatogramsA - sinapine thiocyanate reference substance, B - semen raphani, C -test sample, D - negative control; 1 - sinapine thiocyanate

2.4 标准曲线的制备

精密称取芥子碱硫氰酸盐对照品23.72 mg置20 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为1.10 mg·mL-1，作为贮备液。取贮备液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，作为中间液。分别精密量取中间液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成芥子碱硫氰酸盐浓度分别为0.55、1.10、2.21、5.52、11.04、22.08、44.16 μg·mL-1的对照品系列溶液。将上述对照品系列溶液分别进样10 μL，按照“2.1”项下色谱方法进行高效液相色谱分析，记录峰面积。以浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得芥子碱硫氰酸盐回归方程：Y= 32 242X- 9 679.1，相关系数r= 0.999 9。结果表明，芥子碱硫氰酸盐在0.55 ～ 44.16 μg·mL-1浓度范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

取芥子碱硫氰酸盐对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，记录峰面积。结果显示，芥子碱硫氰酸盐峰面积的RSD为2.30%（n= 5），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取批号为190701的供试品6份，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法处理，平行制备6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果显示，芥子碱硫氰酸盐含量为0.033 7%，RSD = 0.30%（n= 6），表明本方法重复性良好。

2.7 方法检测限与定量限

精密吸取“2.4”项下对照品溶液，加甲醇逐级稀释，进样，记录色谱图，在信噪比为3∶1时，测得检测限为0.99 μg·g-1，在信噪比为10∶1时，测得定量限为2.76 μg·g-1。

2.8 回收率试验

称取混合均匀的供试品2 g（批号：190701）于50 mL容量瓶，分别精密加入对照品贮备液（1.104 mg·mL-1）490、630、730 μL，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法处理供试品，分别制备成低、中、高3个水平的加标供试品溶液，加标量分别为540.96、695.52、805.92 μg。每个水平制备3份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率，平均回收率为106.08%（RSD=0.71%，n= 9），结果见表1。

2.9 稳定性试验

将制备好的供试品溶液和对照品溶液，在室温放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h后分别上机测定芥子碱硫氰酸盐，供试品溶液和对照品溶液中芥子碱硫氰酸盐峰面积RSD分别为0.50%和1.50%（n= 5），表明上述溶液在室温放置8 h内稳定性良好。

表1 回收率测定结果. n = 9Tab 1 Results of recovery tests . n = 9

2.10 样品中芥子碱硫氰酸盐含量测定

取三批中试样品（批号：20190701、20190702、20190703），分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果显示芥子碱硫氰酸盐含量分别为0.032 8%、0.032 9%、0.033 4%。

3 讨论

3.1 专属性考察[1]

在含量测定专属性试验中，分别制备了莱菔子对照药材溶液，缺少莱菔子药材的阴性样品溶液及空白溶剂按“2.1”项下色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，莱菔子对照药材溶液在与芥子碱硫氰酸盐对照品色谱峰相应的位置有相同的色谱峰出现，空白溶剂及阴性对照溶液在芥子碱硫氰酸盐峰位置处无相应色谱峰出现，不干扰本品含量测定。

3.2 提取方法和时间考察[2]

在供试品制备过程中，比较甲醇、50%甲醇、70%甲醇三种提取溶剂，结果显示70%甲醇提取效果较好。故确定本品溶剂为70%甲醇。同时考察了不同提取时间（20 min、30 min、40 min）对含量的影响，结果显示超声30 min时含量高于20 min，超声40 min与30 min时供试品中芥子碱硫氰酸盐含量基本一致，故确定本品提取时间为30 min。

3.3 色谱条件的选择

参照文献[1,3-6]，选择乙腈-0.08 mol·L-1KH2PO4溶液为流动相，普通C18色谱柱，通过调整流动相的比例，改变流速等，都未能达到理想的分离效果，对照品峰有拖尾，重现性不好，有时甚至不出峰。分析原因可能是芥子碱硫氰酸盐在流动相中溶解性不好，样品中待测组分峰与相邻杂质小峰未能有效分离。以缓冲盐为流动相，若使用不当会造成柱压升高、柱效下降以及化合物保留时间变化等问题。参照《中华人民共和国药典》（2015年版）一部莱菔子药材标准，以乙腈-3%冰醋酸水溶液（15∶85）为流动相，采用普通C18色谱柱，通过调整流动相比例，改变流速等也未能达到理想的分离效果，对照品峰有拖尾，样品中待测组分峰与相邻杂质小峰未能有效分离，试用苯基柱后，通过调整流动相比例，以乙腈-3%冰醋酸水溶液（12∶88）为流动相，供试品中芥子碱硫氰酸盐峰与相邻杂质峰能够达有效分离且分离度良好。

3.4 系统耐用性考察

为了考察微小变动因素对本品含量测定的影响，调节流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）、柱温（30 ℃、35 ℃）及将苯基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，上海月旭科技股份有限公司）更换成另一根苯基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，菲罗门科学仪器有限公司），进行实验，RSD均符合要求。在测试条件有微小变动时，测定结果基本不受影响。

3.5 含量限度考察

根据上述三批含量测定数据，结合大生产工艺因素及不同批次间药材含量高低差异，为确保成品质量，暂定儿童开胃乐中芥子碱硫氰酸盐含量不得少于0.026%。