转BtCry1Ac欧洲黑杨的外源基因插入位点分析及特异性检测*

张 磊 胡建军

(林木遗传育种国家重点实验室 国家林业和草原局林木培育重点实验室 中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091)

杨树(Populus)作为我国主要的能源林、纸浆用材林、生态防护林树种，易受舞毒蛾(Lymantriadispar)、杨尺蠖 (Apocheimacinerarius)等鳞翅目(Lepidopteron)昆虫危害(Wangetal.,1996)。杀虫剂等化学防治虽能有效防控，但成本高，长期使用对自然生态系统和生物多样性影响深远。基因工程方法为抗虫杨树新品种培育提供了潜在的途径。

苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)可在不伤害人、动物或有用的寄生昆虫的情况下将昆虫中肠上皮细胞插入靶膜并形成气孔，从而裂解中肠上皮细胞损害舞毒蛾等幼虫的消化系统(Whiteleyetal.,1986；Vachonetal.,2012；Hilbecketal.,2018)。目前，Bt已成功转化烟草(Nicotianatabacum)、棉花(Gossypiumspp.)、水稻(Oryzasativa)、甘薯(Dioscoreaesculenta)、杨树等植物(田颖川等，1991;戴小枫等,1997；Zhongetal.,2019)。1989年中国获得首例转BtCry1Ac基因欧洲黑杨(P.nigra)，田间试验证明转基因杨对杨尺蠖和杨梦尼夜蛾(Orthosiaincerta)具有很强抗性同时兼具生长快的特性(田颖川，1993；Wangetal.,1996;Huetal.，2001;2014)。丹红杨(P.deltoides‘Danhong’)与转BtCry1Ac欧洲黑杨杂交子代对舞毒蛾有显著抗性，且生长优良(张春玲等,2008;贾会霞等,2017)。目前，我国已培育欧美杨、美洲黑杨、小黑杨、毛白杨(P.tomentosa)等10多个抗虫转基因杨，其中转BtCry1Ac欧洲黑杨和转双抗虫基因741杨[P.alba× (P.davidiana+P.simonii) ×P.tomentosa] 2个抗食叶害虫转基因杨树品种已进入了商业化应用阶段，并在2014年种植转BtCry1Ac欧洲黑杨490 hm2，转基因杨树人工林有效地抑制了目标害虫的快速传播，并大大减少了杀虫剂的数量(胡建军等,2010;Huetal.,2014)。因此抗虫转基因杨生态环境安全性研究具有重要意义，虽然田间试验已表明转BtCry1Ac杨树的花粉传播距离有限，并且在大量非转基因雄性存在下，成功产生Bt后代的发生概率非常少(Huetal.,2017)，但外源BtCry1Ac基因在转基因杨树中的稳定性及插入位点是安全性评价的重要内容之一。

T-DNA插入位点可能影响目的基因、插入位点上下游基因的表达情况，侧翼序列的分析对研究转基因杨树的遗传稳定性以及转基因植物的安全生产具有重要意义(许文涛等,2008;王晓波等,2010)。目前插入位点鉴定方法主要有高效热不对称交错PCR 法 (high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR，hiTAIL-PCR)和全基因组重测序技术。hiTAIL-PCR具有特异性高、价格低廉的特点，已成功应用于水稻、油菜(Brassicanapus)、大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)等多种转基因作物的检测(Zhangetal.,2011；申爱娟等，2014；郭超等，2017；蔡勤安等，2018)。本研究以我国首个转基因BtCry1Ac杨为研究材料，利用hiTAIL-PCR技术确定外源基因侧翼序列，建立特异性检测方法，并对T-DNA插入位点上下游基因表达量检测，旨在为转基因杨树外源基因检测提供合理有效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以转BtCry1Ac基因欧洲黑杨2个高抗株系(n12、n222)、丹红杨× n222杂交子代(B3-44、B3-102、B3-132、B3-153)、非转基因欧洲黑杨CK3、丹红杨为试验材料。n12包含BtCry1Ac基因全长3 534 bp，n222包含BtCry1Ac基因N端1 836 bp，以上植物材料均保存于中国林业科学研究院玉泉山实验苗圃。

1.2 试验方法

1.2.1 侧翼序列扩增 2019年4月采集转基因杨树及对照新鲜叶片并利用CTAB法提取DNA，以Bt-F、Bt-R为引物PCR鉴定转基因材料。采用hiTAIL-PCR技术扩增T-DNA侧翼序列，其中简并引物 LAD1、LAD2、LAD3、LAD4 的序列参考文献(Liuetal.,2007)，根据载体设计左右边界引物LB-0A/LB-1A/LB-2A、RB-0A/RB-1A/RB-2A(表1)，并进行3轮PCR反应。LB-0A/RB-0A分别与LAD1、LAD2、LAD3、LAD4进行第1轮PCR；将第1轮PCR产物稀释40倍为模板，LB-1A/RB-1A与AC1为引物进行第2轮PCR；将第2轮PCR产物稀释10倍为模板，LB-2A/RB-2A与AC1为引物进行第3轮PCR。具体反应程序参照文献(Liuetal.,2007)。将第2、3轮PCR产物经1%凝胶电泳，利用Takara切胶回收试剂盒回收第3轮产物，连接pMDTM19-T Vector，送北京赛默飞世尔公司测序。

1.2.2 序列比对与分析 利用DNAMAN进行序列比对识别载体及基因组序列，基因组序列与毛果杨(P.trichocarpa)基因组(3.0)(https:∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)比对分析，确定插入位点。利用ePlant(http:∥bar.utoronto.ca/eplant_poplar/)数据库获取插入位点上下游基因不同组织表达谱。

1.2.3 转BtCry1Ac杨PCR 特异性检测 根据插入位点设计特异性引物，特异性PCR 检测反应在25 μL 体系中进行：1 μL 10 μmol·L-1正向引物，1 μL 10 μmol·L-1反向引物，1 μL T-DNA 特异性引物(表1)。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35 个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物经1%凝胶电泳检测。

表1 插入位点引物序列Tab.1 Primer sequences for insertion sites

1.2.4 实时荧光定量PCR分析 利用天根RNA试剂盒提取CK3、丹红杨、转基因杨嫩叶总RNA，经凝胶电泳检测提取RNA的完整性。利用天根反转录试剂盒来合成cDNA。利用Primer3.0(http:∥primer3.ut.ee/)设计引物，以Actin为内参基因对插入位点上下游基因进行实时荧光定量PCR分析(表2)。3次生物学重复及4次技术重复。采用2-ΔΔCT法分析qRT-PCR试验数据，并利用Excel作图。

表2 实时荧光定量PCR引物Tab.2 Primer sequence for qRT-PCR

2 结果与分析

2.1 转基因植株鉴定

对含BtCry1Ac基因pBIN437质粒测序获取抗虫杨插入T-DNA的完整信息(图1A)。对转基因杨树进行PCR检测，转基因欧洲黑杨n12、n222及其与丹红杨杂交子代均扩增获得与阳性对照相同的目的条带，而未转基因欧洲黑杨、丹红杨未扩增出目的条带，同时半定量结果表明BtCry1Ac基因在转基因株系稳定表达，证明转基因材料中含有BtCry1Ac基因(图1)。

图1 PCR检测转基因植株及转基因表达量Fig.1 PCR detection of transgenic plants and expression level of BtCry1AcA：pBIN437质粒图谱；B：转基因株系PCR检测；C：BtCry1Ac基因半定量PCR检测。M:DL2000 DNA marker;1-8依次为CK3、丹红杨、n12、n222、B3-44、B3-102、B3-132、B3-153(B3:丹红杨×n222)。A:T-DNA of vector pBIN437;B:PCR detection of transgenic poplar;C:Semi-quantitative PCR analysis of the BtCry1Ac.M:DL2000 DNA marker;1-8:CK3,Populus deltoides ‘Danhong’,n12,n222,B3-44,B3-102,B3-132,B3-153(B3:P.deltoides ‘Danhong’×n222).

2.2 转BtCry1Ac欧洲黑杨n12的T-DNA插入位点

将转BtCry1Ac欧洲黑杨株系n12右边界 hiTAIL-PCR 的第2轮和第3 轮扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳分离，以AC1、RB-1A为引物的第2轮和AC1、RB-2A为引物的第3轮扩增结果如图2A所示。随机引物LAD3第3轮产物应比第2轮小80 bp(图2A)。将随机引物LAD3的第3轮扩增产物切胶回收连接T载体，并测序获得215 bp DNA片段，与毛果杨数据库比对发现其中102 bp与15号染色体10162773-10162874 bp区段序列完全一致。初步确认 T-DNA 在欧洲黑杨中的整合位点为Potri.015G076600第2个内含子(即15号染色体10162773 bp)。利用RB-2A和RB-F扩增获得较长右翼序列709 bp，1-133 bp与pBIN437载体右边序列完全一致，134-709 bp为Potri.015G076600序列，RB缺失24 bp(5′-GTTTACCCGCCAATATA TCCTGTC-3′，图2B)，576 bp的基因组AT碱基含量为64%左右。

图2 转BtCry1Ac欧洲黑杨n12右边界序列Fig.2 Right boundary sequence of transgenic P.nigra n12 with BtCry1Ac A:转基因株系n12右边界hiTAIL-PCR电泳结果(M:DL2000 DNA marker;LAD1、LAD2、LAD3、LAD4为简并引物;2:AC1与RB-1A为引物PCR产物;3:AC1与RB-2A为引物PCR产物);B:n12右边界序列及拼接位置特征。A:The hiTAIL-PCR of right boundary in n12(M:DL2000 DNA marker;LAD1,LAD2,LAD3,LAD4 are degenerate primers;2:The PCR products of AC1 and RB-1A;3:The PCR products of AC1 and RB-2A);B:Right-boundary sequence and splicing position characteristics of n12.

2.3 转BtCry1Ac欧洲黑杨n222及其杂交子代的T-DNA插入位点

转BtCry1Ac欧洲黑杨株系n222的4条随机引物第2轮和第3轮产物电泳，发现简并引物LAD4的第2、3轮产物相差89 bp(图3A)，将条带回收连接T载体，并测序获得215 bp DNA片段，1-122 bp为载体序列，123-215 bp与毛果杨数据库比对发现与1号染色体41596063-41596184 bp区段序列完全一致，为基因间隔区。利用LB-F、LB-2A进行长片段扩增获得包括1 143 bp基因组序列和122 bp载体序列的片段，载体LB缺失3 bp(5′-TGG-3′，图3B)，并发现1 143 bp的基因组序列AT碱基含量约为69%。

图3 转BtCry1Ac欧洲黑杨n222左边界序列Fig.3 Left boundary sequence of transgenic P.nigra n222A:转基因株系n222左边界 hiTAIL-PCR电泳结果(M:DL2000 DNA marker;LAD1、LAD2、LAD3、LAD4为简并引物;2:AC1与LB-1A为引物PCR产物;3:AC1与LB-2A为引物PCR产物);B:n222左边界序列及拼接位置特征。A:The hiTAIL-PCR of left boundary in n222(M:DL2000 DNA marker;LAD1,LAD2,LAD3,LAD4 are degenerate primers;2:The PCR products of AC1 and LB-1A;3:The PCR products of AC1 and LB-2A);B:Left-boundary sequence and splicing position characteristics of n222.

2.4 转BtCry1Ac欧洲黑杨插入位点特异性鉴定

根据已确定的转基因杨 T-DNA 的整合位点，分别在n12及n222整合位点两侧的基因组设计正向引物和反向引物RB-F/RB-R、LB-F/LB-R(图4)。转基因杨n12 RB-F 和 RB-R 引物位点序列长度为1 159 bp，RB-2A和 LB-F 之间距离为709 bp。转基因杨n222 LB-F 和 LB-R 引物位点序列长度为1 827 bp，LB-2A和 LB-F之间距离为1 265 bp。

图4 转BtCry1Ac欧洲黑杨n12(上)、n222(下)插入位点序列特异性检测引物位置Fig.4 The location of specific primers for insertion site of transgenic P.nigra n12 (top) and n222 (bottom)

以非转基因杨作为对照，转基因株系n12和n222以 RB-F、RB-2A、RB-R 3条引物进行PCR，结果发现，在n12扩增出709 bp(转基因)和1 159 bp(非转基因)2个特异性片段，而对照及n222只能扩增出1 159 bp的非转基因特异性条带；而以LB-F、LB-2A、LB-R 3条引物进行PCR时，n222、杂交子代扩增出1 265 bp(转基因)和1 827 bp(非转基因)2个特异性片段，对照、丹红杨、n12均只扩增1 827 bp条带(图5)。PCR结果表明，RB-F、RB-2A、RB-R能特异性识别n12转化事件；LB-F、LB-2A、LB-R能特异性识别n222及杂交子代转化事件。

图5 转BtCry1Ac欧洲黑杨n12、n222插入位点特异性PCR检测结果Fig.5 Specific PCR assay for insertion site of transgenic P.nigra n12 and n222A:转基因株系n12右边界特异性检测(M:DL2000 DNA marker;1-4:CK3,n12,n12,n222);B：转基因株系n222左边界特异性检测(M:DL2000 DNA marker;1-8:CK3,P.deltoides ‘Danhong’,n12,n222,B3-44,B3-102,B3-132,B3-153)。A:Specific PCR detection on right boundary in n12(M:DL2000 DNA marker;1-4:CK3,n12,n12,n222);B:Specific PCR detection on left boundary in n222(M:DL2000 DNA marker;1-8:CK3,P.deltoides ‘Danhong’,n12,n222,B3-44,B3-102,B3-132,B3-153).

2.5 转BtCry1Ac欧洲黑杨插入位点附近基因的表达

株系n12插入Potri.015G076600第2个内含子，编码丝氨酸蛋白激酶 (serine-protein kinase,SPK)；下游2.7 kb处为Potri.015G076700 共济失调毛细血管扩张症突变家族蛋白(ataxia telangiectasia mutated family protein,ATM)(Chr15:10165471..10198538)。株系n222及杂交子代插入位点上游10 kb左右为Potri.001G395700(Chr01:41584863..41586527)，下游17 kb处为Potri.001G395800(Chr01:41613393..41617032)。Potri.001G395700编码异黄酮-7-O-β-葡萄糖苷6″-O-丙二酰转移酶 (isoflavone-7-O-β-glucoside 6″-O-malonyltransferase,IBG)，Potri.001G395800 编码光敏色素互作因子解旋酶(PIF1-like helicase,PIF)。根据ePlant数据库RNA-seq数据发现SPK、ATM、IBG在木质部、根、叶、花均有表达，其中木质部表达量最高，而未收录PIF表达情况(图6A)。

荧光定量PCR显示，T-DNA的插入对内源基因的表达产生影响。n12叶片中SPK表达量上调，是非转基因对照CK3的4.3倍，ATM表达量下调，较对照降低20倍(图6B)。丹红杨、n222及其杂交子代IBG、PIF表达量较CK3均增加，其中B3-153IBG表达量最高，为CK3的4倍、丹红杨的2.6倍；n222PIF表达量最高，为CK3的9.6倍。

图6 插入位点附近基因表达分析Fig.6 The expression levels of genes located at the T-DNA insertion sitesA:SPK、ATM、IBG基因组织特异性表达分析;B:株系n12嫩叶 SPK、ATM表达分析;C:株系n222及杂交子代嫩叶IBG、PIF表达分析。DH：丹红杨。A:Tissue specific expression of SPK,ATM and IBG;B:Relative expression level of SPK and ATM in transgenic P.nigra n12;C:Relative expression level of IBG and PIF in transgenic P.nigra n222 and hybrids.DH：P.deltoides ‘Danhong’.

3 讨论

T-DNA主要通过单链缺口修复模型(single-stranded gap repair model,SSGR)、DNA双链断裂修复模型(double-strand break repair model,DSBR)2种整合修复模型整合进入受体基因组(杨琳等,2011)。植物基因组与T-DNA主要通过同源或非同源末端连接(Yoshiyamaetal.,2013；Hirakawaetal.,2015)。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻及山杨(P.davidiana)的研究中发现T-DNA偏向插入富含AT、转录起始、聚腺苷酸化位点等基因组活跃区域(Barakatetal.,2000;Kumaretal.,2000;Szabadosetal.,2002;Yongetal.,2006)。研究发现T-DNA异常重组容易引起T-DNA序列的删除和重复及植物染色体重排：易位、丢失、倒位和重复(Nacryetal.,1998;杨琳等,2011)。

本研究通过hiTAIL-PCR确定转BtCry1A欧洲黑杨株系n12、n222的插入位点。n12定位于Chr15，T-DNA整合进入基因组时，右边界发生24 bp缺失；n222定位于Chr01，左边界缺失3 bp。n12和n222插入位点均位于AT含量较高区域。但未能获得n12的左边界和n222的右边界。王晓波等(2010)发现EPSPs基因的整合导致大豆基因组135 kb片段移位。转JERF36、SacB、ZxZF3个基因欧美杨‘渤丰1号’(P.euramericana‘Bofeng1’)T-DNA左右边界缺失同时发现载体骨架序列整合入受体染色体(崔旭东,2012)。白桦杂交种(Betulaplatyphylla×B.pendula)转BpCCR1的黄叶突变体的T-DNA插入引起3个染色体片段易位及40 kb的缺失(冮慧欣,2019)。因此可能由于T-DNA的插入引起基因组或载体骨干序列的变化从而无法获得另一侧序列。

外源基因插入位点与其上下游编码基因距离太近可能会影响其上下游基因的表达(郭超等，2017)。例如，水稻BlC893插入位点上游140 bp、下游248 bp均存在编码基因，T-DNA插入影响基因表达并导致株高变矮、结实率降低等非期望效应(魏岁军，2014；邓力华等，2014)。水稻J4突变体T-DNA插入导致插入位点附近AK100376基因表达量显著下降(刘航等，2017)。本研究中，n12插入位点为Potri.015G076600第2个内含子，其表达量为CK3的4.3倍，上游2.7 kb 处Potri.015G076700表达量显著降低；田间试验发现n12不仅表现抗食叶害虫危害同时树高、胸径及木质素含量等均显著大于非转基因CK3(Zhangetal.，2018)，这可能是由于T-DNA插入引起基因表达量变化导致。n222 T-DNA插入位点虽位于基因间隔区，但其上游10 kb Potri.001G395700和下游17 kb的Potri.001G395800表达量同样发生变化，因此T-DNA插入基因间隔区仍不可避免地会对内源基因表达造成影响。丹红杨×n222杂交子代IBG和PIF表达量发生不同程度变化，可能由于杂交育种过程中遗传物质重组使杂交子代表现不同的特性。

4 结论

本研究分析转BtCry1Ac欧洲黑杨n12、n222 T-DNA插入位点，发现T-DNA 偏好插入富含AT区域，同时T-DNA载体边界序列缺失，并引起插入位点附近基因表达量变化。三引物组合鉴定n12和n222特异插入位点，这进一步完善了商品化转BtCry1Ac杨的遗传背景信息，为转BtCry1Ac欧洲黑杨的应用和监管提供了技术基础。