山核桃贝壳杉烯氧化酶基因CcKO的克隆和表达分析*

梁 璧 张佳琦 任 飞 胡恒康 徐川梅 胡渊渊 黄有军 娄和强 张启香

(浙江农林大学林业与生物技术学院 省部共建亚热带森林培育国家重点实验室 杭州 311300)

山核桃(Caryacathayensis)隶属胡桃科(Juglandaceae)山核桃属(Carya)，是我国特有的优质干果和木本油料树种，在主产区具有重要的经济、社会和生态价值(黄坚钦等，2002)。近年来，随着生活水平的提高，人们对于山核桃的需求逐渐上升，产品供不应求。然而，山核桃大多种植于山坡沟坎，因其树体高大，管理十分困难，导致产量低、品质差，同时，采收伤亡事件时有发生(俞飞飞等，2011)。因此，创制矮化或半矮化新种质对于山核桃产业的可持续发展十分重要。

赤霉素(gibberellins，GAs)作为一类植物激素，对植物的生长发育具有重要的调控作用，包括种子萌发、茎干伸长、开花诱导和果实发育等(Davièreetal.,2013；王弋等，2018；温璐华等，2017)。研究表明，果树的矮化受多种因素调控，其中内源GAs含量的变化是重要原因之一。目前GAs突变体在果树育种中的利用已证实人为调控GAs信号是实现果树高产稳产的有效方法之一(Dongetal.,2014)。GAs生物合成过程中受多种关键酶调控，如上游关键酶古巴焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase,CPS)、内根-贝壳杉烯合酶(ent-kaurene synthase,KS)、内根-贝壳杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase，KO)和内根-贝壳杉烯酸氧化酶(ent-kaurenoic acid oxidase,KAO)，以及下游关键酶GA20氧化酶(GA20-oxydase,GA20ox)、GA3氧化酶(GA3-oxydase,GA3ox)和GA2氧化酶(GA2-oxydase，GA2ox)等(Kaietal.,2016；Heddenetal.,2012；Shietal.,2018)。内根-贝壳杉烯氧化酶KO是GAs合成上游的单基因调控酶，它是一个依赖于细胞色素P450和NADPH的单加氧酶，属于CYP701家族，通过催化贝壳杉烯C19最后形成贝壳杉烯酸(Morroneetal.,2010)。研究表明，GAs合成过程中KO的失调表达是果树株高变化的重要原因之一(王文然等，2017)。Davidson等(2004)研究发现，在KO基因位点上发生阻塞会使豌豆(Pisumsativum)的下胚轴和节间变短，根的生长减少，叶片缩小。Helliwell等(1998)研究表明，拟南芥(Arabidopsisthaliana)ga3突变体可导致拟南芥种子不发芽、植株矮化、雄性不育等。Itoh等(2004)在水稻(Oryzasativa)中发现GA缺陷型半矮化突变体d35也是由于OsKO2位点变异引起。石琰景(2002)研究发现苹果(Malusdomestica)M26矮化砧木的接穗中GAs含量减少，是由于砧木中KO的合成能力降低。此外，Mao等(2017)研究发现玉米(Zeamays)ZmKO同源基因在真菌感染时可大量表达，并参与其应激反应，推测可能在胁迫反应中发挥作用。Li等(2016)研究发现鲁桑(Morusmulticaulis)MmKO基因的表达量与正常生长环境相比，在非生物胁迫条件下表达水平有显著变化。Zhang等(2020)研究发现在水稻OsKO1突变体中淀粉合成和ABA信号感应能力减弱，从而延缓种子萌发。这些研究结果为GAs生物合成及植物生长调控的研究提供了新的思路。

目前，已在拟南芥(Helliwelletal.,1998)、豌豆(Davidsonetal.,2004)、水稻(Itohetal.,2004)、印度南瓜(Cucurbitamaxima)(Helliwelletal.,2000)、甜叶菊(Steviarebaudiana)(Humphreyetal.,2006)、玉米(Alexandrovetal.,2009)、黄瓜(Cucumissativus)(胡宏敏等，2012)等草本植物以及苹果(田义轲，2004)、沙梨(Pyruspyrifolia)(李节法等，2010)、碧桃(Amygdaluspersicavar.persicaf.duplex)(石琰景，2002)等多年生果树中相继克隆获得KO基因，然而，在果树中，大多未对KO基因的表达进行深入分析。在胡桃科植物中，目前也未见对KO基因的克隆及功能分析。本研究以山核桃为试验材料，通过KO基因全长及启动子克隆、生物信息学分析以及遗传转化，以初步探究山核桃KO基因的生物学功能，旨在利用生物技术手段从基因水平调控山核桃的生长发育，为山核桃矮化/半矮化新种质的分子辅助育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料及培养条件

以省部共建亚热带森林培育国家重点实验室培育的山核桃体细胞胚和核桃(Juglansregia)体细胞胚为试验材料。培养条件为改良后的DKW 固体培养基，23 ℃暗箱培养。体胚再生植株在(25±2)℃、光照周期16 h/8 h、光照强度40～50 μmol·m-2s-1的组培室培养(胡恒康等，2011)。

1.2 山核桃KO基因编码区全长及启动子序列的克隆与载体构建

山核桃体胚RNA的提取采用北京天根生化科技有限公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，DNA的提取采用杭州昊枫生物科技有限公司的Plant DNAzol植物基因组DNA快速提取试剂盒。在克隆过程中所用到的各种限制性内切酶、连接酶、PrimerSTAR高保真酶、cDNA反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒以及后续阳性鉴定用的rTapDNA聚合酶均购自TaKaRa公司。

根据山核桃KO基因序列，设计相关引物(表1)。参照Saito等(2013)PCR扩增体系，并将PCR程序调整为94 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min 30 s，共32个循环；68 ℃延伸7 min(本研究中KO基因编码区全长和启动子克隆均采用同一PCR程序)，获得山核桃KO基因编码区全长(CcKO)和CcKO启动子序列的片段。山核桃CcKO过表达载体构建是将克隆的山核桃KO编码区全长片段与带有GFP报告基因的pC1300载体连接，载体酶切位点为BamHⅠ和SalⅠ(张佳琦等，2019)，所得载体命名为35S∷CcKO∷GFP；山核桃CcKO启动子表达载体构建是将克隆的山核桃KO启动子片段与带有GUS报告基因的pC1301载体连接，载体酶切位点为SalⅠ和NcoⅠ (Regnaultetal.,2014)，所得载体命名为CcKOpro∷GUS。将山核桃KO过表达载体和山核桃KO启动子表达载体质粒转入大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α感受态细胞，提取阳性单克隆菌株进行PCR鉴定，阳性菌株送至杭州有康生物技术有限公司测序。将测序结果比对正确的菌液提取质粒，转化农杆菌，然后对单菌落进行PCR鉴定，正确的保菌用于后续试验。

表1 引物序列①Tab.1 Primer sequence

1.3 山核桃CcKO基因及启动子表达载体在核桃中的遗传转化及KO基因表达分析

将构建好的载体转入农杆菌(Agrobacterium)GV3101中并扩大培养，测得OD值为1.0左右，根据公式计算离心的菌液量=(悬浮的体积×0.5)/(OD600×10)，5 000 r·min-1离心10 min，分别获得山核桃KO过表达载体和山核桃KO启动子表达载体的农杆菌工程菌菌株。之后选取生长健壮的核桃体胚进行遗传转化(Walawageetal.,2014)。

将过量表达山核桃CcKO基因的核桃体胚置于体视荧光显微镜(Carl Zeiss Stereo D13covery V12，Axio Cam MRc system，蓝光 488 nm)下进行检测，观察体胚荧光激发情况；对具有绿色荧光GFP激发的核桃体胚进一步开展核桃转化阳性体胚验证，验证方法同扩增PCR体系(引物参照表1)。经鉴定为阳性的CcKO基因过表达体胚培养至子叶胚阶段，干化处理3～5天后转接于萌发培养基中进行植株再生，培养条件参考张启香等(2011)。CcKO基因过表达植株萌发后进一步进行再生植株阳性验证，并剪取生长健壮且长度相等的转化植株的茎尖(1 cm)培养20天，观察植株表型并统计数据。

将转化山核桃CcKO启动子的核桃体胚置于GUS染液中染色以检测CcKO启动子的阳性体胚。于37 ℃下染色8 h(Ruebetal.,1989)。阳性体胚进一步培养成再生植株，同样的方法进行阳性植株鉴定并观察其表型。

1.4 核桃阳性再生植株中KO及GA20ox、GA2ox基因的相对表达量检测

分别选取生长健壮的对照植株和核桃35S∷CcKO∷GFP转化植株3个株系的顶芽、叶片和茎，提取RNA，反转录成cDNA，利用实时荧光定量PCR(qPCR)观察KO基因在不同组织部位中的表达量以及KO基因过量表达对于GAs合成下游关键酶GA20ox和GA2ox的影响(定量引物参照表1，其中JrGA20ox和JrGA2ox参考设计的定量引物登录号分别为：XM_018972764.1;XM_018969434.1)。qPCR反应体系为10 μL，包含cDNA 0.4 μL，TB GREEN 5 μL，正向引物0.2 μL，反向引物0.2 μL，RNase-freeWater 4.2 μL。反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40个循环；65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s。结果通过2-ΔΔCT法计算(Livaketal.,2011)。取样的标准：顶芽为从最顶端开始1 cm处取样，叶片为再生植株除顶芽外的叶片混样，茎为再生植株中去除顶芽和叶的部分。

2 结果与分析

2.1 山核桃KO基因编码区全长及启动子的克隆和序列分析

2.1.1 山核桃KO基因编码区全长的克隆及过表达载体的构建 以生长健壮的山核桃体胚为材料，提取RNA，并进行反转录，再以反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，凝胶电泳显示条带在1 500 bp左右。连接pC1300-GFP载体并转化大肠杆菌，进一步菌检显示条带大小为1 500 bp左右，条带大小与预期结果一致，测序比对正确后获得山核桃KO基因的编码区全长序列并将其命名为山核桃CcKO基因(Caca0733S0131)，构建的CcKO基因过表达载体命名为35S∷CcKO∷GFP。

2.1.2 山核桃KO基因启动子的克隆及载体构建 以生长健壮的山核桃体胚为材料，提取DNA，并以DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示条带为2 000 bp左右，连接pC1301-GUS载体并转化大肠杆菌，菌检条带显示在2 000 bp左右，与预期结果一致，测序比对后获得山核桃KO启动子的序列并将其命名为山核桃PCcKO启动子，构建的载体命名为CcKOpro∷GUS。

2.1.3 山核桃CcKO基因推导的氨基酸序列及理化性质分析 ORF Finder 软件显示山核桃CcKO基因开放性阅读框(ORF)全长1 563 bp，编码520个氨基酸(图1)；ExPASy在线软件显示该基因所编码的蛋白相对分子质量59.076 kDa，等电点(pI)8.04，分子式C2673H4220N700O763S22；PSORT在线分析软件显示山核桃CcKO基因亚细胞定位34.8%位于线粒体，17.4%位于细胞质，13%位于内质网。

图1 CcKO的核苷酸序列及推导的氨基酸序列Fig.1 Sequence of CcKO and its deduced amino acid sequence

BLAST比对发现山核桃CcKO基因属于细胞色素超家族P450系。山核桃CcKO基因编码的氨基酸序列与核桃JrKO氨基酸(NW_017443530.1)同源性为96%，与欧洲栓皮栎(Quercussuber)KO(NW_019812880.1)的同源性为79%，与板栗(Castaneamollissima)KO(AEF32084.1)的同源性为77%，与苹果MdKO(AAS68017.2)的同源性为76%，与白梨(Pyrusbretschneideri)KO(NW_008988041.1)的同源性为71%。

将克隆的山核桃CcKO基因推导的氨基酸序列与GenBank 中已报道的其他物种的KO氨基酸序列进行同源性比对(图2)，结果表明，山核桃CcKO具有真核生物CYP450的氧化还原位点PERF、底物结合域ETLR，以及距离羧基端52—61位氨基酸的血红素结合域FGGGKRVCAG，该区域也是山核桃CcKO的半胱氨酸(C)亚铁红素结合位点。这与已报道的在沙梨(李节法等，2010)、黄瓜(胡宏敏等，2012)和野甘草(Scopariadulcis)(Yamamuraetal.,2018)中一致，说明该家族具有高度保守性。

图2 不同物种KO氨基酸序列同源性比较Fig.2 Comparison of KO amino acid sequence homology among different species红色方框内为细胞色素p450特有的结构域。In the red box are specific domains of cytochrome p450.Jr:核桃 Juglans regia;Os:欧洲栓皮栎Quercus suber;Md:苹果Malus domestica;Pb:白梨Pyrus bretschneideri;Cm:板栗Castanea mollissima;Hb:橡胶树Hevea brasiliensis;Pm：梅Prunus mume;Cc:山核桃 Carya cathayensis.

2.2 山核桃PCcKO启动子的遗传转化及KO基因定位分析

选取生长健壮的核桃体胚进行遗传转化(该体胚记为E0代体胚，E0表面产生的新体胚记为E1代体胚，以此类推)，用制备好的CcKOpro∷GUS启动子表达载体的农杆菌菌液进行侵染，培养至E1、E2、E3代分别进行GUS染色。研究结果发现，GUS染液浸染8 h后部分转化体胚呈现明亮的蓝色，其中越靠近胚芽，染色越深(图3A)，对照体胚无显色反应(图3E)。统计结果表明，E1代体胚GUS阳性率为30%，E2代体胚GUS阳性率为50%，E3代体胚GUS阳性率为70%(表2)。进一步对E3代中GUS染色呈蓝色的体胚进行PCR检测(图4A)，样品获得2 000 bp条带，与预期大小一致，统计PCR阳性率为100%。待GUS阳性体胚萌发成完整植株，进一步对再生植株进行PCR检测，条带大小为2 000 bp的株系确定为阳性植株(图4B)，统计结果表明阳性率为75%。对已鉴定的转化植株茎叶进行GUS染色，结果发现：阳性植株叶片的小叶叶脉处呈现明显的蓝色，其中主叶脉最为明显(图3B)，而对照植株叶片染色后无蓝色(图3F)。进一步对再生植株茎徒手切片横切面GUS染色后发现，转化的阳性植株茎横切面维管束部位显示明显的蓝色，而表皮、皮层和髓薄壁细胞蓝色较浅；进一步对茎纵切面进行染色，同样显示维管束部位为明显的蓝色，而表皮、皮层和髓薄壁细胞显色反应较弱(图3C、D)；对照植株茎横切面和纵切面染色后无蓝色(图3G、H)。因此，推测该山核桃CcKO基因主要定位在维管束中。

图3 核桃CcKOpro∷GUS阳性体胚及再生植株的GUS定位分析Fig.3 GUS localization analysis of CcKOpro∷GUS positive somatic embryos(SE) and regenerated plants(RP) in walnuts标尺 Scale bar A,C,D,E,G,H:500 μm;B,F:100 μm.A:GUS阳性体胚；B:GUS阳性再生植株叶片；C:GUS阳性再生植株的茎横切面；D:GUS阳性再生植株的茎纵切面；E:对照体胚；F:对照再生植株叶片；G:对照再生植株茎的横切面；H:对照再生植株茎的纵切面。A:GUS positive SE;B:GUS positive RP leaves;C:Cross section of stem of GUS positive RP;D:Longitudinal section of stem of GUS positive RP;E:Control SE;F:Control RP leaves;G:Cross section of stem of control RP;H:Longitudinal section of stem of control RP.

表2 山核桃PCcKO在核桃体胚(SE)和再生植株(RP)中的阳性率统计①Tab.2 Statistics on the positive rate of PCcKO in walnut somatic embryos(SE) and regenerated plants(RP)

图4 核桃 CcKOpro∷GUS阳性体胚及再生植株的PCR鉴定Fig.4 PCR identification of walnut CcKOpro∷GUS transformed positive SE and RPM:5000 marker.A:核桃 CcKOpro∷GUS阳性体胚的PCR鉴定(1：对照体胚；2-7：阳性体胚)；B:核桃 CcKOpro∷GUS阳性再生植株的PCR鉴定(1-8:阳性再生植株；9:对照再生植株)。M:5000 Marker.A:PCR identification of walnut CcKOpro∷GUS positive SE(1:Control SE;2-7:Positive SE)；B:PCR identification of walnut CcKOpro∷GUS positive RP (1-8:Positive RP;9:Control RP).

2.3 山核桃CcKO基因在核桃中的遗传转化及表达分析

2.3.1 山核桃CcKO基因在核桃中的遗传转化及阳性检测 选取生长良好的核桃体胚进行遗传转化(图6A)。用制备好的35S∷CcKO∷GFP过表达载体的农杆菌工程菌液侵染核桃体胚。E0代体胚培养至2周左右，在子叶表面会出现颗粒状E1代体胚。体视荧光显微镜下可以观察到核桃体胚的发育经历了球形胚、心形胚、鱼雷胚以及子叶胚阶段(图5)。在白光视野下，转化体胚和对照体胚均呈白色透明状。在蓝光激发下，经转化获得的GFP阳性体胚表达出强烈的绿色荧光信号，而未转化成功的体胚及对照体胚无荧光信号(图5)。通过荧光检测计算GFP体胚阳性率，结果显示：E1代转化体胚GFP阳性率为46%；将E1代GFP阳性体胚培养至E2代，GFP阳性率为65%；E3代的GFP阳性率为83%(表3)。

图5 核桃35S∷CcKO∷GFP转化体胚的荧光表达Fig.5 Fluorescence expression of walnut 35S∷CcKO∷GFP transformed SE标尺 Scale bar D,H,L,P:100 μm；其余 The rest:500 μm.A,B,C,D:自然光下的转化核桃体胚；E,F,G,H:蓝光激发下的转化核桃体胚；I,J,K,L:自然光下的对照核桃体胚；M,N,O,P：蓝光激发下的对照核桃体胚。A,E，I，M:球形胚；B,F，J，N:心形胚；C,G，K，O:鱼雷胚；D,H，L，P:子叶胚。A,B,C,D:Transgenic SE of walnut under natural light;E,F,G,H:Transgenic SE of walnut stimulated by blue light;I,J,K,L:Control SE of walnut under natural light;M,N,O,P:Control SE of walnut stimulated by blue light.A,E，I，M:Globular embryos;B,F，J，N:Heart-shaped embryos;C,G，K，O:Torpedo embryos;D,H，L，P:Cotyledon embryos.

表3 山核桃CcKO在核桃体胚(SE)不同培养代数中的阳性率统计Tab.3 Statistics of the positive rate of CcKO in walnut somatic embryos (SE) with different subculture

图6 核桃35S∷CcKO∷GFP的阳性体胚及再生植株的PCR鉴定Fig.6 PCR identification of positive SE and RP in walnut 35S∷CcKO∷GFPM:DL5000 marker;-：WT(阴性对照Negative control) ;+:35S∷CcKO∷GFP(阳性对照 Positive control).A：生长健壮的核桃体胚；B：GFP阳性体胚的PCR鉴定(1-8:转化的核桃体胚)；C：转化植株；D：转化植株的PCR鉴定(1-8:转化植株)。A:SE of walnut;B:PCR identification of GFP positive SE(1-8:Transformed walnut SE);C:Transgenic plants;D:PCR identification of transgenic plants(1-8:Transgenic plants).

为排除假阳性，进一步提取E3具有绿色荧光信号的体胚DNA进行PCR检测，凝胶电泳后发现，大部分GFP阳性体胚条带在1 500 bp左右，而少数GFP阳性体胚以及对照体胚无条带(图6B)，E3代PCR检测阳性率为75%。将E3转化体胚萌发成完整植株(图6C)然后提取DNA进一步进行PCR检测，将条带大小与载体质粒的条带大小一致(1 500 bp)的株系确定为转化阳性植株(图6D)，统计结果表明阳性率为62.5%，对照植株无相应条带。

2.3.2 山核桃CcKO基因生物学功能的初步分析 1)CcKO基因过量表达对核桃转化植株株高的影响 为了探寻山核桃CcKO基因过量表达与核桃再生植株株高之间的相关性，选取3个转化阳性株系进行表型分析，3个株系分别命名为：35S∷CcKO∷GFP-1、35S∷CcKO∷GFP-2和35S∷CcKO∷GFP-3。截取相同长度(1 cm)的茎尖接入芽生长培养基(图7A)，培养20天后测量植株的株高和节间长度(图7B)。结果表明：与对照相比，3个阳性株系的株高均显著增加，且叶片更大(图7C、D)。其中，对照植株的平均株高17 mm，节间长4 mm；35S∷CcKO∷GFP-1阳性再生植株平均株高23.4 mm，比对照增加37.6%，节间长5.6 mm，比对照增加40.0%；35S∷CcKO∷GFP-2阳性再生植株平均株高22.5 mm，比对照增加32.4%，节间长5.4 mm，比对照增加35.0%；35S∷CcKO∷GFP-3阳性再生植株平均株高20.2 mm，比对照增加18.8%，节间长4.8 mm，比对照增加20.0%。

图7 核桃35S∷CcKO∷GFP 转化植株的表型分析Fig.7 Phenotypic analysis of 35S∷CcKO∷GFP transgenic walnut plants标尺 Scale bar:10 mm.A,B:对照及转化阳性植株分别在0 d和20 d的株高表型；C:对照及转化阳性植株的叶片表型；D：株高及节间长统计分析，单因素方差分析显著性，不同字母表示差异显著(P<0.05)。A,B:Plant height phenotypes of control and transgenic plants at 0 d and 20 d respectively;C:The leaf phenotypes of control and transgenic plants;D:Statistical analysis of plant height and internode length,significance of one-way ANOVA,different letters indicate significant difference (P<0.05).

2)CcKO基因过量表达对核桃转化植株KO基因表达的影响 为了进一步研究过量表达山核桃CcKO基因对核桃再生植株中KO基因表达量及空间表达特征的影响，提取转化阳性植株和对照植株的顶芽、叶和茎RNA，通过qPCR检测核桃转化阳性植株和对照植株中不同部位KO基因的相对表达量。结果发现，在转化植株中，各器官KOmRNA表达量均显著高于对照，其中茎中KOmRNA表达量增加最多，为对照植株的5.3倍，叶和顶芽中表达量分别为对照植株的3.2倍和2.7倍。此外，KOmRNA表达具有明显的空间差异，无论在转化阳性植株还是对照植株中，KOmRNA的空间表达模式相似，即茎中的KOmRNA表达量均显著高于顶芽和叶(图8)。说明KO基因主要在茎中表达。

图8 核桃转化植株中CcKO的qPCR空间差异分析Fig.8 Spatial difference analysis of CcKO in transgenic walnut plants by qPCR单因素方差分析显著性，*表示差异显著(P<0.05)。Significance of one-way analysis of variance,* indicates significant difference (P<0.05).

3)CcKO基因过量表达对核桃转化植株赤霉素合成下游关键酶基因的影响 为了研究赤霉素(GAs)合成通路中上游KO基因过量表达对下游关键酶基因的影响，本研究检测了核桃35S∷CcKO∷GFP转化植株不同部位JrGA20ox基因和JrGA2ox基因的相对表达量。结果表明：对照植株中，顶芽、叶和茎之间的JrGA20oxmRNA表达量差异不显著。在核桃转化阳性植株中，JrGA20ox表达量具有明显的空间差异，其中在茎中的表达量显著高于顶芽和叶片，表达量分别为顶芽和叶的2.1倍和2.3倍；顶芽和叶片中表达量差异不显著。此外，与对照植株相比，转化阳性植株顶芽和茎中JrGA20oxmRNA相对表达量显著升高，分别为对照的3.1倍和2.6倍；叶中表达量与对照相比差异不显著。由此，可以推测JrGA20ox表达趋势与KO基因表达量一致，为正调控(图9A)。

进一步对JrGA2ox基因的相对表达量进行检测，结果表明，在对照植株中顶芽中的表达量显著高于叶片和茎，其表达量为叶或茎的1.8～2倍，而叶和茎中表达量差异不显著。在核桃转化阳性植株中，JrGA2ox表达量具有明显的空间差异，且表达量均显著低于对照的相应部位，其中在顶芽、叶片、茎的表达量分别仅为对照植株的7%、18%、51%。由此，可以推测JrGA2ox的表达趋势与KO基因相反，为负调控(图9B)。

图9 CcKO过量表达对赤霉素合成下游关键酶基因的影响Fig.9 The effect of CcKO overexpression on key enzyme genes downstream of gibberellin biosynthesisA:核桃阳性再生植株中GA20ox基因的相对表达量;B：核桃阳性再生植株中GA2ox基因的相对表达量。利用单因素方差分析进行差异显著性分析，不同字母表示差异显著(P<0.05)。A:The relative expression of GA20ox gene in walnut positive RP;B:The relative expression of GA2ox gene in walnut positive RP.Single factor analysis of variance is used to analysis the differences,and different letters indicate significant difference (P<0.05).

3 讨论

赤霉素(GAs)作为植物生长调控的重要激素，它参与植物生长发育的整个过程。GAs缺乏易引起植物发育不良、矮化、雄性不育等现象(陈晶晶等，2014)，因此对植物GAs生物合成途径中各个关键酶的研究显得尤为重要。Faust(1992)研究认为果树树形的改变是以GAs为中心的激素代谢不平衡造成的。朱海涛等(2008)也认为GAs是控制树体大小的最重要激素。KO是GAs生物合成途径上游关键酶，也是植物GAs合成抑制剂多效唑(PP333)的靶酶，如果GAs生物合成途径中在KO基因位点发生阻塞，也会影响植株的正常生长(Miyazakietal.,2011)。因此，研究GAs合成通路中KO基因的生物学功能对于调控果树树形及树体大小具有十分重要的意义，并可为果树种质创新和分子辅助育种提供重要依据。

KO是GAs生物合成上游关键酶，催化GAs合成途径的三步顺序氧化反应。本研究克隆获得山核桃CcKO基因编码区全长及启动子PCcKO序列，将该基因的氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列进行比对发现，CcKO具有羧基端的血红素结合域FGGGKRVCAG和氨基端的疏水结构域PPVVPGLP以及氧化还原位点PERF，说明CcKO属于细胞色素P450家族，这与在沙梨(李节法等，2010)、黄瓜(胡宏敏等，2012)和野甘草(Yamamuraetal.,2018)中的报道一致，说明细胞色素P450家族具有高度保守性。BLAST比对发现，CcKO编码的氨基酸与核桃JrKO的同源性最高，为96%；与白梨、苹果、板栗、欧洲栓皮栎的同源性分别为71%、79%、77%、76%。此外，李节法等(2010)发现沙梨PpKO与苹果MdKO在同一进化枝，且同源性最高达到95.9%；胡宏敏等(2012)发现黄瓜CsKO与苦瓜(Momordicacharantia)McKO氨基酸的同源性达到84%，与豌豆、草莓(Fragaria×ananassa)、拟南芥、小立碗藓(Physcomitrellapatens)的同源性分别为64%、61%、60%、63%，说明植株在进化过程中，亲缘关系越近，同源性越高。

GAs合成关键酶基因的表达差异可导致植株株高的改变(石建斌等，2018)。Helliwell等(1998)、Davidson等(2004)和Itoh等(2004)分别在拟南芥、豌豆和水稻中发现KO基因突变均导致植株矮小，水稻过表达OsKO1基因可使突变体恢复表型(Zhangetal.，2020)。本研究通过异源转化发现过量表达CcKO基因，可使核桃再生植株株高显著高于对照，表明过量表达该基因可促进植株长高，该结论进一步验证了前人的研究结果。此外，组织特异性研究表明，KO基因表达具有明显的空间差异。拟南芥AtKO基因在所有组织中均有表达，其中在花序中表达量最高(Helliwelletal.,1998)；豌豆PsKO基因在根、茎和种子中均可表达(Davidsonetal.,2004；Itohetal.,2004)；黄瓜CsKO基因的表达量与下胚轴长度有关，表达量越高，幼苗的下胚轴越长(胡宏敏等，2012)；野甘草中SdKO主要在根和侧根中表达，而根和侧根属于伸长组织(Yamamuraetal.,2018)。本研究中，qPCR结果显示山核桃CcKO基因在核桃顶芽、叶和茎中均有表达，其中茎中表达量最高，其原因可能是KO参与GA12-醛的合成，而GA12-醛又是各种GA代谢的底物，因此会在核桃的各个组织表达(王西成等，2012)。GUS组织化学定位分析显示CcKO启动子能够指导报告基因在核桃的叶脉和茎中表达，进一步徒手切片显示该基因主要定位在维管束中。PlantCARE在线软件分析发现CcKO启动子包含G-box、I-box等光效应顺式作用元件及TATCCA序列。研究表明，TATCCA序列能够结合MYB转录因子，参与调控植物初生和次生代谢、控制细胞的成长和分化以及参与植物防卫反应和逆境胁迫应答等生物学过程(杨郁文等，2012)。因此，初步推测山核桃CcKO基因主要是通过调控茎中维管组织的代谢和细胞生长，进而调控植株的生长发育。

KO通过一系列氧化作用，将贝壳杉烯形成贝壳杉烯酸，贝壳杉烯酸在贝壳杉烯酸氧化酶KAO的作用下形成GA53(Kaietal.,2016)。GA20ox和GA2ox是赤霉素生物合成途径下游的关键酶，GA20ox能将GA12和GA53催化形成有活性的GA20和GA9，GA20ox表达量增加可使植株体内GAs含量增加，从而促使植物生长加快(Giacomellietal.,2013)。GA2ox是GA降解过程的关键酶，它能维持体内GAs的平衡，将具有生物活性的GAs和中间体分解失活(Wuddinehetal.,2015)。GA2ox过量表达会导致植株矮化，GAs含量降低。Ko等(2009)在体外酵母表达系统中验证了KO能将贝壳杉烯形成贝壳杉烯酸，当KO过量表达时，GA20ox氧化酶的表达量增加。宋杨等(2012)在不同时期提取‘长富2号’苹果RNA并进行GA20ox和KO基因表达分析，发现其相对表达变化趋势相似。在拟南芥ga1-3突变体中，GA20ox1表达量升高时，GA2ox的转录水平明显下降(黄先忠等，2006)。本研究qPCR结果显示：当上游基因KO表达量增加时，下游基因GA20ox表达趋势与KO一致，即表达量提高；GA2ox表达趋势则相反，即表达量下降。因此，可以初步判断山核桃CcKO基因与GA20ox表达正相关，与GA2ox表达负相关，进而协同调控植株的生长发育。

综上，调控果树树体高度的因素很多，想要阐明其调控机制，需开展大量有关GAs合成路径中其他关键酶及信号转导通路等的研究。本研究克隆得到山核桃CcKO基因编码区全长和PCcKO启动子序列，并成功在核桃体胚中遗传转化，其结果为在分子水平上利用基因敲除、定向突变等手段研究KO的生物学功能提供了基础，同时也为果树树形调控提供了理论依据和技术手段。

4 结论

山核桃CcKO基因编码区序列为1 563 bp，编码520个氨基酸，该基因所编码的氨基酸序列与核桃JrKO氨基酸序列同源性最高，同源性为96%。CcKO启动子GUS染色结果表明，该基因主要定位于维管束中。核桃的遗传转化试验结果表明，KO基因mRNA在茎中相对表达量最高，表达丰度与株高呈正相关；在核桃再生植株中，KO基因与下游GA20ox基因正相关、GA2ox基因负相关。本研究结果为山核桃和核桃矮化/半矮化新种质的分子辅助育种提供理论依据，也为进一步解析该基因在其他果树中的生物学功能提供参考。