濒危植物树枫杜鹃的结实及种子萌发特性*

杨 阳 王海洋 马立辉

(1.西南大学园艺园林学院 重庆 400700；2.重庆市林业科学研究院 重庆 400036)

树枫杜鹃(Rhododendronchangii)是杜鹃花科常绿灌木，为重庆金佛山的特有种，现存个体数量稀少，分布区狭窄，被《中国生物多样性红色名录·高等植物卷》列为易危物种，也被列入《重庆市重点保护野生植物名录》。目前，有关树枫杜鹃的研究仅限于种群结构及伴生群落特征(杨阳等，2018)、菌根的分离与鉴定(刘振华等，2012)。植株的结实状况、种子萌发及幼苗生长等是种群繁殖生态学的研究基础(Harper,1977)，对濒危植物进行繁殖特性的研究有助于掌握种群的发育生活史、更新动态及生态适应性等(黄红兰等，2013；Willson,1983)，也有助于探究繁殖阶段的濒危机制。种子萌发是种群自然更新的基础，研究濒危植物种子萌发特性是种群保护与恢复及人工扩繁的关键(李文良等，2008；臧润国等，2016；Herranzetal.,2010)。种子萌发受到母体环境、萌发阶段环境、种子表型作用等多因子的影响(黄振英等，2012；Baskinetal.,2014)，种子的形态表型变异会对其萌发特性产生影响(杨帆等，2012;Wangetal.,2012)，此类植物主要生长于岩石、干旱半干旱区、荒漠等恶劣的环境中(王雷等，2010)。

树枫杜鹃生长于灌丛与疏林下的石灰岩上，且其种子形态变异明显。本文旨在研究：1)树枫杜鹃种群的结实状况及单株结实量、果实、种子3个层次的结实特性，分析环境因子对结实特性的影响；2)母株的光照条件及母株的性状(株高、年龄等)、果实性状(果实颜色、蒴果开裂程度等)、种子形态表型(种子形态、种翅大小等)是否为影响树枫杜鹃种子萌发的主要因素；3) 不同的光照、温度等环境因子以及用不同浓度的GA3溶液浸种处理，对种子萌发的影响。通过以上研究，阐明树枫杜鹃结实及种子萌发的繁殖生物学特性及生殖问题，为揭示树枫杜鹃的濒危机制及制定保育策略提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 种群分布区概况 金佛山(29°01′14.51″N—29°01′39.48″N，107°10′35.16″E—107°10′57.07″E)，海拔2 105～2 164 m。踏查共发现4个树枫杜鹃集中分布的种群，分别生长于灌丛中(种群1与种群2)、常绿阔叶-苔藓矮林(种群3)以及常绿落叶阔叶混交林下(种群4)，且均以沿着悬崖边缘成带状分布为主，本区的气候特点属亚热带湿润季风气候区，气候温和，雨量充沛；常年平均气温低于8.3 ℃，年均日照1 079.4 h，年均降水量1 395.5 mm。本区基质为石灰岩，且石灰岩大块裸露，地表枯枝落叶层厚(2～10 cm)，覆盖度大。林分较简单，树木多呈丛生，林下箭竹(Fargesiaspathacea)覆盖度大，草本植物稀少，仅有少许苔草、蕨类，而苔藓植物较多。

1.2 不同种群中的结实状况 在2018年4月树枫杜鹃的花蕾期，对4个种群进行每木调查，并统计开花母树的株数。采用空间代替时间的方法，用基径代表树龄(达良俊等，2004)，计算每个种群中开花母树的平均株高、冠幅及基径，在每个种群中各选择3株接近平均值的母树统计花蕾数，并挂牌标记作为后期采集蒴果的标准株。在2018年9月果实成熟期，将标准株树冠等分成上、中、下3层分别统计每株的蒴果数量，并选择6个标准枝采集蒴果，将每株的果实分别编号放入塑封袋带回实验室。在果实开裂前，用游标卡尺测量果长与果径，待果实室温风干开裂后，计数每个果实中的种子数，之后将同一株的种子混匀。在每株混匀的种子中随机各选取30粒，用安装有数码相机(Moticam2306,3.0 Mpixel)的体式显微镜(SMZ-168)拍照，然后使用显微测量软件ImageJ测量种长、种宽、种翅长及种翅宽。用百粒法测量种子千粒质量，从每株的种子中随机数取100粒称质量；将种宽/种长≥0.4的种子定义为卵圆形种，种宽/种长<0.4的种子定义为长圆形种，在体式显微镜下分别统计100粒种子中2种形状种子的数量，同时并统计饱满种子数，各重复8次。

1.3 结实特性与环境因子的相关性 按照母株不同的株高、冠幅、基径以及不同的坡向、林下透光度等在4个种群中共选择24个样株，统计每个样株的蒴果数量，每株选择6个标准枝采集蒴果。统计单果种子数、果长、果径等果实性状，以及种子千粒质量、种长、种宽等种子性状，测量方法同1.2。

1.4 母株、果实及种子的性状差异对种子萌发的影响 在24个样株(同1.3)中，按照果实在树冠上的不同位置、蒴果不同开裂程度、不同果径与果长、不同颜色等果实性状，分株依次采集蒴果若干。待果实室温风干开裂后，取出种子，再按照不同的种宽/种长的比值、种翅长等种子表型性状对种子进行分类(表1)，果实与种子性状的测量方法同1.2，共划分为30组由不同母株、果实、种子表型性状组成的种子进行萌发实验。供试种子先经0.3%高锰酸钾溶液消毒30 min后用蒸馏水冲洗干净，再用200 mg·L-1的GA3溶液浸种24 h。处理后的种子放入直径9 cm、垫有2层滤纸的培养皿中，加入适量蒸馏水浸湿滤纸，置于以25 ℃、80%RH及2 000 lx、12 h·d-1为环境条件的人工气候箱中进行萌发试验。每皿100粒，每组3个重复。试验期间，保持滤纸湿润，并每3天更换1次滤纸。以胚根长度超过种子直径一半作为萌发标准(宋松泉等，2008)，连续5天无种子萌发与萌动视为萌发结束，每24 h观察并记录种子萌发数。萌发试验结束后，以胚根严重扭曲定义为畸形苗(丁琼等，2006)，统计每组幼苗中的畸形苗比例，并从每组中随机抽取早期萌发的幼苗各30株，测量根长与茎长。

表1 影响种子萌发的因素变量Tab.1 Variable factors affecting seed germination

1.5 不同环境因子对种子萌发的影响 1) 不同光照因子 试验选用大小中等的黄褐色饱满种子(以下试验相同，以避免种子表型性状的影响)。在25 ℃、80%RH及12 h·d-1的光照时间下，将种子分别置于0、500、1 000、2 000、5 000 lx共5个光照下进行萌发试验。种子前期处理、萌发实验方法及幼苗测量同1.4。

2) 不同温度因子 在2 000 lx、12 h·d-1及80%RH的条件下，将种子分别置于5、10、15、20、25、30 ℃共6个温度梯度下进行萌发试验。种子前期处理、萌发试验方法及幼苗测量同1.4。

1.6 不同浓度的GA3溶液浸种处理 将经消毒的供试种子分别用0、100、200、400、600、800 mg·L-16个浓度的GA3溶液浸种24 h，在25 ℃、80%RH及2 000 lx、12 h·d-1的条件下进行萌发试验。萌发试验方法及幼苗测量同1.4。

1.7 数据处理 选用萌发率(GP)、萌发时滞(GTL)、萌发持续时间(GD)、畸形苗比例(DSP)、简化活力指数(SVI)等5个指标衡量种子萌发特性，即GP(%)=萌发种子数/100×100%，GTL(d)为从萌发试验开始到第1粒种子萌发间隔的时长，GD(d)为从第1粒种子萌发到萌发试验结束的时长，DSP(%)=畸形苗株数/幼苗总株数，SVI=GP×(根长+茎长)×100(宋松泉等，2008)。5个萌发指标及由母株的光照、蒴果开裂程度、种宽等性状组成的18个影响因子指标(表2)，分别与30组萌发种子构成5×30的萌发特性矩阵与18×30的影响因子矩阵，在CANOCO 5.0中进行排序分析，排序时SD为0.7，故采用冗余分析(RDA)来检验种子的不同性状对萌发特性的影响，同时，为消除冗余变量与共线性因子的影响，用前向选择结合Monte Carlo检验筛选对萌发特性影响显著的因子(P<0.05)。结实特性与环境因子的相关性以及利用单因素方差分析(ANOVA)检验不同处理下萌发特性的差异性(LSD,P<0.05)均在SPSS22.0中完成，统计结果以平均值±标准误( Mean±SE)表示。

2 结果与分析

2.1 不同种群的结实特性 1) 种群结实状况及单株结实量特征 树枫杜鹃不同种群的结实状况与单株结实量均存在差异(表2)。相比生长于乔木林下的种群，生长于灌丛的种群1与种群2的结实母树较低矮，且结实母树的平均年龄也较小。结实母树的数量与比例通常作为衡量林分繁殖能力的主要标准(罗大庆等，2010)，4个种群中的结实母树共93株，结实母树比例在39.58%～66.67%之间，生长于灌丛与常绿阔叶-苔藓矮林中的种群结实母树比例大于林下种群。单株蒴果数量为17～48个，不同种群间差异显著，林下种群4的单株结实数最少；从结实的空间分布来看，蒴果集中分布于树冠上层，且显著多于中层与下层，中层与下层的蒴果数量差异不显著。座果率为43.90%～58.62%，种群4中的座果率最低。由此说明，生长于灌丛的种群结实状况明显优于林下种群。

表2 种群结实状况及单株结实量特征①Tab.2 Fruiting quantity characteristics of population and individual plants

2) 果实特征 由表3可知，树枫杜鹃的果长、果径均值分别为(1.55±0.20)cm与(0.78±0.11)cm，种群3、种群4的蒴果较大。单个蒴果包含的种子数差异显著，种群2与种群3的单个蒴果种子数超过600粒，显著大于其余2个种群，种群4中最少。单果种子饱满率在9.89%～15.71%之间，种群2中种子饱满率最高，显著高于种群3与种群4。生长于林下的种群4的单果种子数及种子饱满率均较低。

表3 果实特征Tab.3 Cone characteristics

3) 种子特征 由表4可知，树枫杜鹃种子千粒质量为0.22～0.35 g，变异系数较小，种群3与种群4的千粒质量较大。种子长度为1 032.6～1 953.7 μm，种子宽度为289.4～768.2 μm，种翅长度为1 738.7～3 957.0 μm，种翅宽度为407.8～806.5 μm，其中，相比于种群3与种群4，种群1与种群2的种子长度与种翅长度显著较小，而种子宽度与种翅宽度显著较大。种宽/种长的比值范围为0.16～0.74，种群1与种群2的种宽/种长比值的均值显著大于种群3与种群4。相比于种子千粒质量，种子大小的变异系数较大，不同形状的种子选育潜力大。4个种群中卵圆形种子/长圆形种子数量的比值均值为0.42±0.23，种群1与种群2中的卵圆形种子所占比例显著高于种群3与种群4。

表4 种子特征Tab.4 Seed characteristics

2.2 结实特性与环境因子的相关性 从结实特性与植株生长量及环境因子的相关分析可知(表5)，座果率、单株结实数与母株生境的透光度、坡向呈极显著正相关(P<0.01)。果长、果径、单果种子数、种子千粒质量与母株的株高、冠幅呈显著正相关(P<0.05)，反映了果实大小、种子重量主要受到母株长势的影响，同时单果种子数也与母株的透光度与坡向呈极显著正相关。种子大小与种子饱满率受母株性状与小生境的影响较大，种宽、卵圆形/长圆形种子数的比值以及种子饱满率与母株的基径呈极显著负相关，与母株透光度、坡向呈极显著正相关，而种长、种翅长与之相反。

表5 结实特性与环境因子间的相关系数①Tab.5 Coefficient correlation between seed setting characteristics and environmental factors

2.3 母株、果实及种子性状差异对种子萌发的影响 1) 种子萌发影响因素的RDA冗余分析 在原始的18个因素变量中，利用前向选择结合Monte Carlo检验(P<0.05)，提取了6个代理变量，共提取95.5%的因素信息量(表6)。树枫杜鹃种子萌发主要受种子形态变异的影响，种宽/种长的比值影响最大，其累积解释量为82.8%；其次为母株所在小生境的透光度，其累积解释量为6.3%；种子萌发也与种宽、种长、母株基径极显著相关(P<0.01)，与果实开裂程度显著相关(P<0.05)。

表6 前向选择中各变量的条件影响①Tab.6 Conditional effects of variables on forward selection

排序前两轴的累积贡献率为96.5%，说明排序结果良好(图1)。由排序图可知，种子萌发率、幼苗活力指数与种宽、种宽/种长的比值、透光度呈正相关，与种长、母株基径、果实开裂程度呈负相关；而畸形苗比例、萌发时滞、萌发持续时间与种长、果实开裂程度、母株基径呈正相关，与透光度、种宽、种宽/种长的比值呈负相关。由此说明，母株的光照越充足、种宽及种宽/种长的比值越大，越有利于树枫杜鹃种子萌发；而母株年龄过大、果实开裂程度越完全以及种长越长，种子的萌发力越弱。

2) 不同形态的种子萌发力比较 根据种宽/种长的比值分为2类种子，即卵圆形种子(种宽/种长≥0.4)、长圆形种子(种宽/种长<0.4)。对30组种子萌发力的分析表明，不同形态的种子萌发力差异显著(P<0.05)(图2)。卵圆形种子的萌发率显著高于长圆形种子，而畸形苗比例、萌发时滞、萌发持续时间均显著低于长圆形种子。由图3可知，长圆形种子的幼苗生长速度更快，其根长、茎长、苗长均显著高于卵圆形种子，但长圆形种子的幼苗活力指数显著低于卵圆形种子。

图2 种子的不同形态对萌发力的影响Fig.2 Different shape on seed germination 不同小写字母表示同一研究对象间差异显著(P<0.05)。下同。Different lower case letters mean significant difference in the same study object(P<0.05).The same below.

图3 种子的不同形态对幼苗生长势的影响Fig.3 Different shape on seedling vigor

2.4 环境因子对种子萌发的影响 1) 光照对种子萌发的影响 由图4可知，树枫杜鹃种子为需光性种子，光照能促进种子萌发，加快萌发速率。萌发率与光照呈正相关，2 000、5 000 lx光照下萌发率差异不显著(P>0.05)，0 lx光照条件下的萌发率极显著低于其他各组(P<0.01)。畸形苗比例、萌发时滞、萌发持续时间与光照呈负相关，0 lx光照条件下的萌发时滞与萌发持续时间均显著大于其他各组(P<0.05)。幼苗长势试验表明(图5)，根长与光照呈正相关，茎长、苗长与光照呈负相关，0、500 lx光照条件下的根长显著低于其他各组，但茎长与苗长显著高于其他各组；幼苗的活力指数与光照呈正相关，0 lx光照条件下的活力指数显著低于其他各组，其他各组间差异不显著。

图4 光照对种子萌发的影响Fig.4 Effect of light on seed germination

图5 光照对幼苗活力的影响 Fig.5 Effect of light on seedling vigor

2) 温度对种子萌发的影响 树枫杜鹃的种子对温度具有广泛的适应性(图6)，5 ℃萌发启动。在5～25 ℃间，萌发率与温度呈正相关，畸形苗比例、萌发时滞及萌发持续时间与温度呈负相关；温度过低不利于种子萌发，5 ℃时的萌发率极显著小于其他各组(P<0.01)，5～10 ℃的畸形苗比例、萌发时滞、萌发持续时间均显著大于其他各组(P<0.05)。温度过高减弱种子的萌发力，相比于25 ℃、30 ℃时的萌发率降低、畸形苗比例增大。幼苗长势试验表明(图7)，根长、苗长与温度呈正相关，5 ℃时的茎长与苗长显著低于其他各组；5～25 ℃间的幼苗活力指数随温度升高而增大，25 ℃时幼苗活力指数最大，30 ℃时的幼苗活力指数低于25 ℃。

图6 温度对种子萌发的影响Fig.6 Effect of temperature on seed germination

图7 温度对幼苗活力的影响Fig.7 Effect of temperature on seedling vigor

2.5 不同浓度的GA3溶液浸种处理对种子萌发的影响 由图8可知，GA3溶液浸种能促进树枫杜鹃种子萌发，并降低畸形苗比例。GA3溶液浓度为600 mg·L-1时萌发率最高，清水组的萌发率极显著低于其他各组(P<0.01)。清水组的畸形苗比例显著大于其他各组(P<0.05)，其他各组间差异不显著(P>0.05)，其中，400 mg·L-1下的畸形苗比例最低。萌发时滞、萌发持续时间与GA3溶液的浓度呈负相关，清水组的萌发时滞与萌发持续时间均显著大于其他各组，而400～800 mg·L-1下差异不显著。幼苗长势实验表明(图9)，GA3溶液浸种能促进幼苗的生长，根长、茎长、苗长与GA3溶液浓度呈正相关，清水组的幼苗显著低于其他各组；600 mg·L-1下的幼苗活力指数最大，清水组极显著小于其他各组。

图8 GA3溶液浸种对种子萌发的影响Fig.8 GA3 soaking on seed germination

图9 GA3溶液浸种对幼苗活力的影响Fig.9 GA3 soaking on seedling vigor

3 讨论

3.1 树枫杜鹃结实特性及其影响因素 濒危植物比普通种更易受到资源限制(Carlsenetal.,2002)，树枫杜鹃不同种群的结实特性存在差异，其主要受母株光照条件的影响。4个种群中的结实母树均分布于林缘与林隙，灌丛中的种群结实母树比例显著较大，而阔叶林下的种群结实母树比例最小。生殖构件的生长受母株的光照、水分等环境条件影响(黄红兰等，2013；Metslaidetal.,2007)，进而影响到植株结实格局。由于受光照影响，树枫杜鹃结实的层次效应明显，蒴果集中于树冠上层。树枫杜鹃的座果率较低，而种子饱满率更低，大部分濒危植物均有此生殖现象，类似于毛红椿(Toonaciliatavar.pubescens)(黄红兰等，2013)、南川升麻(Cimicifugananchuenensis)(奇文清等，1998)、风箱果(Physocarpusamurensis)(殷东生等，2016)等。此外，相比于适龄母株，年龄过大的树枫杜鹃母株生殖力降低，使座果率与种子饱满率降低，这与濒危植物四合木(Tetraenamongolica)相似(徐庆等，2003；张云飞等，2003)，其座果率也受到母株光照不足抑制。树枫杜鹃果实的发育状况受母株生长量影响的同时，果实大小影响单果种子数与种子千粒质量，即越大的果实中种子数越多、种子千粒质量越大，说明果实发育状况直接影响种子的形成与质量，这与丁炳扬等(2000)对浙江12种杜鹃花属植物的研究结果一致。树枫杜鹃不同形态的种子产量主要受母株光照条件、坡向等的影响，即光照越充足、坡向越向阳，产生的卵圆形种子比例越大。紫翅猪毛菜(Salsolaaffinis)(王宏飞等，2007)、藜(Chenopodiumalbum)(Yaoetal.，2010)等植物中不同形态种子的输出比例也受环境影响。

3.2 树枫杜鹃种子萌发的影响因素 不同的种群生境、母株结实过程中所经历的光照、水分、土壤养分等环境条件及母株年龄等母体效应，以及果实颜色、位置效应等果实性状，均会对种子的萌发特性产生影响(Baskinetal.,2014)，同时，种子的表型变异能提高种子萌发的多样性与赋予植株一定的适应性弹性，以维持种群的稳定性(董鸣，2016)。Yao等(2010)通过对准噶尔盆地南缘的洼地与斜坡2种生境的藜种子萌发特性的研究表明，洼地的黑色种子萌发率显著高于斜坡，但树枫杜鹃在灌丛、乔木林生境中的种子萌发特性无显著差异。目前，关于母株的环境条件对种子萌发特性的影响主要集中于盐分与水分，Wang等(2012)发现不同盐分环境的异子蓬(Borszczowiaaralocaspica)母株产生的黑色与褐色种子萌发率均差异显著；树枫杜鹃母株的光照条件对子代种子的萌发影响显著，母株的光照越充足，种子萌发率与幼苗活力指数越高。对于果实的不同性状，蒴果不同的开裂程度与颜色决定果实的成熟度，果实不同的成熟度与种子质量间交互影响种子的萌发特性(Kaushik,2003;Khosroetal.,2015)，树枫杜鹃的蒴果开裂程度对其种子萌发影响显著，黄绿色微裂的果实中的种子具有最高的萌发率。

树枫杜鹃同一母株上的种子大小产生连续性变异，不同形态表型的种子具有不同的萌发行为，种子的形态变异是其种子萌发特性的最大影响因素，其中种宽/种长的比值解释的信息量为82.8%，即随着种宽/种长的比值增大，其萌发率增大，从而使卵圆形种子的萌发率显著大于长圆形种子。近年来，有关种子异型性的研究已成为适应机制研究的热点(王雷等，2010)，杨帆等(2012)研究表明盐生植物角果碱蓬(Suaedacorniculata)的棕色种子萌发率显著高于黑色种子；李文良等(2008)研究表明连香树(Cercidiphyllumjaponicum)不同颜色、不同种翅大小的种子萌发率存在显著差异；王宏飞等(2007)发现紫翅猪毛菜不同形态的3种类型的种子具有不同的散布特性和萌发行为。植物的种子具有不同萌发行为这一混合生殖策略能提高其对恶劣环境的适合度，使植物在时空异质性的环境中定居(王雷等，2010；黄振英等，2012；董鸣，2016)。不同母株环境的树枫杜鹃表现出不同的生存对策，当母株光照条件充足时，能产生更多的卵圆形种子，卵圆形种子的种翅不发达，种子散布于母株周围，在适宜的环境条件下迅速萌发，以保证种群的维持；而母株光照较弱时，产生较大比例的长圆形种子，长圆形种子的种翅发达，使其能扩散至适宜生存的“安全岛”，以拓宽种群生境。

种子萌发的启动与光照、温度、水分等环境因子密切相关。树枫杜鹃种子具有浅度的需光性休眠，弱光条件下种子萌发率低且畸形苗比率大，GA3溶液浸种能显著提高其萌发率；任祝三(1986)研究表明杜鹃种子的需光性受光敏素的调控，而GA3浸种能降低其启动萌发所需的光敏素水平。其自然居群中郁闭度大、地表枯落物层厚(杨阳等，2019)；周艳等(2015)研究表明，过厚的枯落物层通过减弱光照等影响迷人杜鹃(Rhododendronagastum)种子萌发，因此，树枫杜鹃的种子萌发在自然条件下可能存在阻碍，影响种子向幼苗转化，且杜鹃种子不耐储存(耿兴敏，2010)，野外不利的环境条件将削减种群的潜在规模。树枫杜鹃种子萌发能在较宽的温度范围内启动，5 ℃低温下便开始萌发可能是其对高海拔环境适应的结果，故温度不是其萌发的限制因素。今后，应开展树枫杜鹃自然居群中幼苗向成株转化的更新过程及其分子水平的遗传多样性研究，进一步探究其濒危机制。

4 结论

由于激烈的光竞争，树枫杜鹃在自然群落中的生境适宜性下降，使其逐渐趋于小种群，结实特性受到光资源限制的影响，致使种子产量与种子品质下降，有性生殖力衰退；在野外林下光照较弱等不利的自然条件下，种子向幼苗的转化受到抑制，可能导致其有性生殖受阻；低温即启动萌发，但萌发效率低的特性，增加了种群的风险。应迫切恢复树枫杜鹃种群的残存生境，疏伐林木，减小郁闭度，清理枯落物层，以改善种群及土壤种子库的光照条件，同时进行人工扩繁，以缓解其濒危状态、维持种群的发展。人工育苗应于果实成熟初期采取蒴果微裂的黄绿色果实，并挑选卵圆形的种子进行。