基于iTRAQ定 量蛋白质组学的三文鱼新鲜度分析

马聪聪，张九凯，韩建勋，邢冉冉，郝建雄，陈 颖

（1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018）

三文鱼属于大中型冷水域洄游鱼类，主要分布在太平洋北部及大西洋和北冰洋交界水域。因其肉质鲜美细嫩和高营养价值[1]，近年来逐渐被作为生食料理店的上等原料。因最早出口中国的三文鱼主要来自欧洲，所以严格意义上来讲，传统的三文鱼指的就是大西洋鲑（Salmo Salar）。在我国，三文鱼主要食用方式为生食，因此对其新鲜度的要求非常高[2]。目前常用的新鲜度检测方法有传统感官评价[3]以及在此基础上发展起来的现代化感官仿生识别技术[4-5]、微生物评价[6]和传统理化分析[7-8]，随着光谱技术的发展，具有快速、无损、成本低以及适合在线检测等特点的红外光谱、荧光光谱、核磁共振、拉曼光谱等新兴无损检测技术越来越受到人们的关注[9-11]，但这些技术手段通常是从新鲜度变化的终端入手来表征鱼类所处的新鲜度状态。为进一步探究鱼类新鲜度变化的机理，基于质谱和蛋白质组学的新鲜度研究技术逐渐发展起来。二维电泳耦合质谱技术（two-dimensional electrophoresis coupled mass spectrometry，2DE-MS）即是其中之一。利用二维电泳可以直观地对比出不同品质鱼类中的差异蛋白点，然后通过质谱技术对其进行鉴定，找到变化蛋白，进而分析出贮存过程中新鲜度变化的机理[12-13]，但是二维电泳也存在一定局限性，比如，对于一些酸性蛋白或碱性蛋白不能实现很好的分离。

同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技术是一种多肽体外标记技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高分辨率质谱仪分析，可同时比较多达8 个样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术[14-16]。如Huan Chen等[17]采用iTRAQ技术对不同温度贮存的桃果实成熟衰老过程中的蛋白进行了研究，结果共找到325 种差异表达蛋白，它们主要参与碳水化合物和能量代谢、脂质代谢、氨基酸代谢、信号转导、应激反应和防御等生物学过程。Shi Jing等[18]同样采用该技术对新鲜泥虾和冻融后泥虾肌肉中的蛋白进行了对比分析，共找到226 种差异蛋白，并在进一步的生物信息学分析中探明其品质变化的机理。三文鱼肉质细腻，在人们日常饮食中占据越来越大的比重[19-20]，越来越多的方法应用于三文鱼新鲜度的检测和判定，但对其贮存过程中新鲜度变化机理研究较少，因此本实验采用iTRAQ定量蛋白质组学技术，对0 ℃条件下不同贮存时间三文鱼蛋白进行对比分析，为揭示三文鱼新鲜度变化机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冰鲜三文鱼（物种：大西洋鲑；质量：（6.5±0.2）kg；原产国：挪威），于挪威当地捕捞后立即宰杀，去除内脏，冰鲜空运至北京海关，然后于3 h内运至实验室。

尿素 美国Promega公司；硫脲 美国Americo公司；二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT） 美国Bio-Rad公司；乙腈（色谱纯）、胰蛋白酶 美国Thermo Fisher-Pierce公司；10 kDa离心浓缩装置 美国Sigma公司；Qubit®3.0荧光定量试剂盒 美国Life Invitrogen公司；iTRAQ®Reagent-8Plex试剂盒 美国AB SCIEX公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Nexera X2液相色谱（liquid chromatography，LC）仪日本Shimadzu公司；Triple-TOF 6600高分辨质谱仪美国AB SCIEX公司；Xbridge Peptide BEH C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm，300 Å） 美国Waters公司；Durashell-C18高pH反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，100 Å） 天津Agela公司；pH计、ME403E型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；Qubit®3.0荧光定量仪 美国Life Invitrogen公司；Centrifuge 5418R型离心机、Concentrator plus型真空浓缩仪 德国Eppendorf公司；TissueLyser II组织研磨仪 德国Qiagen公司；Vortex-Genie 2型振荡器 美国Scientific Industries公司；HH-1型数显恒温水浴锅 金坛市白塔新宝仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

样品运至实验室后，将其去皮、去刺、切成均匀小块（平均长（5.0±0.5）cm、宽（5.0±0.5）cm），随机分为4 份装入密封袋中，置于冰上（0±1）℃保存，分别于第0、5、10、15天取样，用于iTRAQ蛋白定量分析（图1）。新鲜对照组（0 d）和不同贮存时间的实验组（5、10、15 d）分别做两组平行，依次标记为0 d-1、0 d-2、5 d-1、5 d-2、10 d-1、10 d-2、15 d-1和15 d-2。

图1 iTRAQ蛋白质组学分析冰鲜三文鱼新鲜度流程图Fig. 1 Flow chart of iTRAQ proteomic analysis for the freshness of chilled salmon

1.3.2 蛋白质提取与定量

样品取出后经组织研磨仪研磨后进行匀浆，准确称取混合均匀的鱼糜1 g，加入15 倍体积的尿素裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲），漩涡混匀后冰浴振荡提取1 h，结束后于4 ℃、12 000×g条件下离心20 min，收集上清液。利用Qubit®荧光定量试剂盒测定蛋白浓度，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）对蛋白质的提取质量和浓度进行验证。

1.3.3 蛋白质酶解

蛋白定量后，参照Wang Chong等[21]的蛋白处理条件，结合iTRAQ®Reagent-8Plex试剂盒说明书进行蛋白酶解。即分别取含有80 μg蛋白的提取液置于离心管中，分别加入4 μL iTRAQ试剂盒中Reducing Reagent溶液，37 ℃水浴反应1 h，加入2 μL Cysteine-Blocking Reagent，室温避光放置10 min，将还原烷基化后的蛋白溶液转移至10 kDa的超滤管中，12 000×g离心20 min，弃掉收集管底部溶液。然后按照酶与底物1∶40的体积比向超滤膜中分别加入2 μg胰蛋白酶，37 ℃条件反应6 h，12 000×g离心20 min，得到酶解后的肽段。

1.3.4 iTRAQ标记

从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，向8 管iTRAQ试剂（图1中编号113～121）中分别加入200 μL异丙醇稀释，然后与对应的肽段样品混合（113和114分别标记0 d-1和0 d-2；115和116标记5 d-1和5 d-2；117和118标记10 d-1和10 d-2；119和121标记15 d-1和15 d-2），室温反应2 h，然后加入100 μL去离子水终止反应。混合标记后的样品，漩涡振荡混匀，取出20 μL混合标记肽段，用Ziptip脱盐后进行Triple-TOF 6600质谱鉴定，以检测标记效率和质量，其余混合液旋转真空干燥后冷冻保存待用。

1.3.5 高pH反相色谱分级

将干燥后的标记肽段溶解在1 0 0 μ L 流动相A（20 mmol/L甲酸铵，pH 10.0）中，用Durashell-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，100 Å）进行洗脱。参考华愉教等[22]的第一维高pH反相液相色谱分离条件，对洗脱条件进行优化，具体为流速0.8 mL/min，流动相B为体积分数80%乙腈溶液（含20 mmol/L甲酸铵，pH 10.0），梯度洗脱程序如下：0～5 min，5% B；5～30 min，5%～15% B；30～45 min，15%～38% B；46 min上升至90% B，并持续至55 min；55～65 min，5% B。总洗脱时间65 min，将前60 min的洗脱液接入60 个1.5 mL离心管中，按极性合并成16 管肽段复合物，真空干燥备用。

1.3.6 高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱分析

参照Wang Zhixiu等[15]的LC-MS条件，对洗脱梯度和质谱去簇电压、碰撞能量等参数进行优化，然后对样品肽段进行LC-MS分析。

高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）条件：色谱柱为Xbridge Peptide BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm，300 Å），流动相A为2%（体积分数，后同）的乙腈溶液（含0.1%甲酸），流动相B为98%的乙腈溶液（含0.1%甲酸）。将16 管分级后的肽段分别用流动相A复溶后进行后续分析。设定流速0.25 mL/min，梯度洗脱程序：0～1 min，2%～5% B；1～30 min，5%～20% B；30～54 min，20%～42% B；54.5～62 min，80% B；62.1～68 min，2% B。

M S 条件：采用正离子扫描模式，扫描范围350～1 500 m/z。雾化器：50 psi；辅助加热气：50 psi；气帘气：35 psi；离子源温度：550 ℃；去簇电压：80 V；离子碰撞能量：10 V。

1.3.7 蛋白质鉴定

使用ProteinPilot 5.0.2软件对分级后的16 管肽段质谱鉴定结果进行合并和数据转换，利用Excel软件对蛋白可信肽段数和覆盖率进行统计和展示说明。三文鱼物种原始蛋白库于Uniprot（http://www.uniprot.org）上进行下载，共含有88 995 条目标肽段序列。

1.4 数据处理与分析

差异表达蛋白筛选标准：P＜0.05，即对两次重复数据进行t检验，P＜0.05的蛋白认为差异显著；差异倍数（fold change，FC）大于1.2或小于0.83，即倍数变化大于1.2（上调）或小于0.83（下调）认为是差异蛋白[21]，利用Origin 9.0软件对目标蛋白进行火山图绘制，并用颜色进行标注（红色代表上调，绿色代表下调），进行后续分析。

利用欧洲生物信息研究所维护的QuickGO（http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/）注释工具对差异蛋白进行基因本体（gene ontology，GO）功能注释[23]，然后利用在线分析工具Omicshare（https://www.omicshare.com/tools）对每个GO条目下富集的差异蛋白进行统计和计算，随后采取超几何检验方法确定出差异蛋白中显著富集的GO条目。利用京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库（http://www.genome.jp/kegg/）对差异蛋白质进行代谢通路分析[21]。

2 结果与分析

2.1 三文鱼肌肉蛋白基本信息

质谱数据经过ProteinPilot 5.0.2软件的搜索和筛选后共获得10 828 个二级谱图，匹配到3 355 个肽段，对应257 个蛋白质，其中可信蛋白150 个。对iTRAQ数据进行进一步整理分析发现这150 个蛋白中，有8 个只含有1 条可信肽段，其余142 个蛋白至少含有两条可信肽段（图2A）。此外，如图2B所示，有42%的蛋白质序列覆盖率即质谱检测出的肽段氨基酸序列占整个蛋白序列的比率超过50%，结果表明蛋白质组学分析是可靠的。

图2 三文鱼蛋白包含的可信肽段数量（A）和蛋白序列覆盖度（B）Fig. 2 Statistics of the number of trusted peptide segments of proteins (A)and protein sequence coverage (B) in salmon

2.2 差异蛋白筛选与分析结果

图3 0 ℃条件下三文鱼贮藏不同时间后的差异蛋白火山图和韦恩图Fig. 3 Volcanic maps and Venn map of differentially expressed proteins in salmon after 5, 10 and 15 days storage at 0 ℃

差异蛋白的筛选条件为“FC大于1.2或小于0.83，P＜0.05”。由差异蛋白火山图（图3A～C）可以直观地看出上调蛋白和下调蛋白分布情况。与贮藏0 d冰鲜三文鱼样品相比，在3 个不同贮存时间的处理组中共找到62 个差异蛋白，其中有29 个蛋白在贮存5 d后发生了显著变化，22 个贮存10 d后发生了变化，52 个在贮存15 d后发生了变化，结果表明随着贮存时间的延长，蛋白变化速率加快。另外，利用韦恩图（图3D）对这些蛋白进行分析发现，有12 个差异蛋白在3 个处理组中均被筛选出来；有6 个蛋白在贮存前5 d没有明显变化，但贮存10 d后开始出现上调或下调，随着生化过程的进行，有24 个蛋白直到贮存15 d后才发生明显变化，可能是由于贮存过程中，一些代谢产物积累而诱发了新的生物反应过程；10 个蛋白随着贮存时间的延长出现了先增多后减少或先减少后增多的变化趋势，进一步证明了蛋白变化与贮存时间具有密切联系。这些蛋白可能是与冰鲜三文鱼品质密切相关的潜在蛋白质生物标志物。

2.3 差异蛋白生物信息学分析结果

图4 0 ℃条件下贮存5、10 d和15 d后三文鱼差异蛋白GO功能注释图Fig. 4 Gene ontology annotation of di-erentially expressed proteins in salmon after 5, 10 and 15 days storage at 0 ℃

通过GO注释分析可以对差异蛋白行使的主要生物学功能进行分类，对3 个比较组的差异蛋白进行GO注释发现，3 组差异蛋白主要参与的生物学进程均包括代谢过程、细胞过程和单有机体过程（图4）；在细胞组分分类中，主要参与细胞、单元部分、高分子络合物以及细胞器组成。在分子功能方面，5 d/0 d比较组中的29 个差异蛋白主要具有催化活性，然后依次为离子结合和ATP/ADP结合；10 d/0 d比较组中的22 个差异蛋白前三大功能依次为催化活性、ATP/ADP结合和核苷酸结合；15 d/0 d比较组的52 个差异蛋白中，主要参与离子结合，ATP/ADP结合、催化活性和核苷酸结合也占较大比例。

利用KEGG数据库分析了不同蛋白质的代谢途径（表1）。发现62 个差异蛋白共参与了56 个代谢途径。其中5 d/0 d和15 d/0 d比较组中的差异蛋白主要富集在代谢通路、糖酵解/糖异生通路、碳代谢通路和氨基酸生物合成通路；10 d/0 d比较组中的差异蛋白重点参与代谢通路、糖酵解/糖异生通路、碳代谢通路和紧密连接通路。

表1 0 ℃条件下贮存5、10 d和15 d后三文鱼差异蛋白显著富集的KEGG通路Table 1 Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway with significant enrichment of differentially expressed proteins in salmon after 5, 10 and 15 days storage at 0 ℃

2.4 差异蛋白与新鲜度相关性分析结果

表2 0 ℃条件下贮存5、10 d和15 d后三文鱼差异蛋白信息Table 2 Information about differentially expressed proteins in salmon after 5, 10 and 15 days storage at 0 ℃

续表2

对3 个比较组的差异表达蛋白进行了综合分析，共筛选出28 个与三文鱼贮存期间品质变化相关的蛋白（表2），其中2 个蛋白在储存初期上调，但随着储存时间的延长开始降解；10 个蛋白在储存5 d时就发生了显著下调，随着储存时间的延长继续发生不同程度的降解；3 个蛋白在储存5 d时没有发生明显变化，但储存10 d后开始减少；13 个蛋白在储存10 d以内含量不变，但储存15 d后发生明显降解。结合生物信息学分析结果，发现它们分别与糖代谢、肌肉收缩、骨架蛋白、能量代谢及脂肪代谢和肽链延伸等功能相关。

2.4.1 糖代谢相关蛋白分析结果

与糖代谢相关的蛋白有7 个，分别为果糖二磷酸醛缩酶（A0A1S2WZE0）、葡萄糖-6-磷酸异构酶（A0A1S3PV75）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（B5DGR3）、磷酸甘油酸激酶（B5DFX8）、磷酸甘油酸变位酶（B5DGT9）、磷酸丙糖异构酶（B5DGL3）和α-1,4-葡聚糖磷酸化酶（B5DG55）。以上差异蛋白均为糖酵解和糖异生途径中重要的催化酶，在贮存第5天开始下调，这主要是由于鱼体死后，血液循环停止，机体不再供氧，但有氧酵解被无氧酵解替代，使肌肉组织中糖代谢过程仍然能维持一段时间，因此短时间内肌肉具有一定的生理活性，相关的催化酶被不断消耗，贮存初期出现缓慢下调。但随着贮存时间的延长，糖原不断减少，乳酸积累，鱼体pH值逐渐下降，糖代谢相关的催化酶被钝化，反应过程停止，进一步导致相关的催化酶被分解，含量出现显著下调。

2.4.2 肌肉收缩相关蛋白分析结果

与肌肉收缩相关的蛋白有9 个，分别为肌球蛋白重链（A0A1S3M1A4）和肌球蛋白-6（A0A1S3R4R2）、肌球蛋白轻链（B5DH12）及其亚型（B5DGT2、B5DGT1）、肌球蛋白调节性轻链（Q7ZZN0）、肌钙蛋白-T（B5DH00）和LDB3蛋白（A0A1S3N253、B5DGH1）。肌球蛋白是肌原纤维粗丝的组成单位，由两条肌球蛋白重链、两条肌球蛋白轻链和两条调节性轻链构成，在肌肉收缩中起重要作用[24]。鱼体死后初期进入僵直阶段，肌原纤维产生收缩张力，肌节中的Z线在持续的张力作用下断裂，肌原纤维小片化程度增大；因此随着贮藏时间的延长，肌球蛋白等会不断降解。在本研究中发现，肌球蛋白重链和肌球蛋白-6在贮存第5天就发生了明显降解，肌球蛋白轻链及其亚型、肌球蛋白调节轻链在贮存后期也发生显著下调，这与Shi Jing等[18]的研究结果一致，符合鱼体死后蛋白变化规律。另外，LDB3蛋白是肌原纤维结构中的一个连接蛋白，通过其LIM域将蛋白激酶C介导的信号耦合到细胞骨架上。三文鱼在0 ℃贮藏过程中，该蛋白质含量迅速下降，主要因为鱼体死后，细胞渗透压升高，导致肌原纤维结构脆弱，使其更易受到水解酶的作用而降解，进而导致相关蛋白减少。该结果与李婷婷[25]对大黄鱼新鲜度研究的结果一致。

2.4.3 骨架蛋白分析结果

在三文鱼贮存期间发生明显变化的骨架蛋白有3 个，分别为角蛋白（A0A1S3LJL5）、肌原调节蛋白（B5DFZ6）和肌联蛋白亚型（A0A1S3PNJ9）。角蛋白是中间丝蛋白家族（也称中间纤维）最大的亚群，主要表达于上皮组织中，具有维持细胞形状的功能。鱼体贮存过程中的自溶作用导致结构相关的蛋白降解，为了维持细胞器的稳定性，角蛋白含量在贮存前期有增多趋势；但贮存后期开始下调，是贮存后期降解作用逐渐增大造成的。肌原调节蛋白是一种骨骼肌Z线蛋白，主要在骨骼肌中表达，而在其他一些组织中的表达水平较低[26]。实验结果显示在冷藏过程中，肌原调节蛋白和肌联蛋白均发生明显降解，主要与鱼肉死后僵直有关，导致肌原纤维的连接和稳定性下降，僵直解除后，鱼肉硬度下降、嫩度提高，使组织蛋白酶更容易作用于结构蛋白，进而导致肌肉弹性变差，品质开始劣变，Wang Chong等[21]利用iTRAQ定量技术对冰点贮存的缢蛏（Razor clam）进行差异蛋白分析，同样发现肌联蛋白与贮存时间呈负相关。

2.4.4 能量代谢相关蛋白

鱼体死后糖酵解的速率是由ATP酶活性控制的，ATP酶活力大小直接影响新陈代谢的能力，进而影响鱼肉品质[27]。参与三文鱼贮存过程中能量代谢的差异蛋白有6 个，其中ATP合酶（A0A1S3NPS0、B5RI36）、ADP/ATP转位酶（B5DGZ1）、线粒体型肌酸激酶（B5DFT9）、腺苷酸激酶同工酶（B5DGM6）显著下调，AMP脱氨酶（B5DFU7）在贮存初期出现微量上调，然后随着贮存时间的延长含量趋于不变。鱼体死后，肌肉组织中开始进行无氧酵解，每分子葡萄糖氧化产生的ATP数由原来的39分子减少到3分子，ATP含量急剧下降，因此导致ATP合酶和ADP/ATP转位酶含量减少。线粒体型肌酸激酶与肌肉收缩、能量合成和能量传递直接相关，能可逆地催化肌酸和ATP之间的转磷酸化反应。该蛋白在贮藏过程中丰度降低，这可能与鱼体死后肌酸的降解有关。腺苷酸激酶同工酶在细胞能量平衡和腺嘌呤核苷酸代谢中起着重要作用。定量结果发现该蛋白在贮存后期出现明显降解，也主要与葡萄糖无氧降解导致ATP产生量急剧减少有关，与冰点贮存的缢蛏（Razor clam）肌肉蛋白中腺苷酸激酶变化趋势[21]一致。鱼体死后，ATP会分解成多种代谢物，包括二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、一磷酸肌苷（inosine monophosphate，IMP）、次黄嘌呤核苷（inosinecreatinine，H x R）和次黄嘌呤（h y p o x a n t h i n e，H x），主要步骤为ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx，其中AMP→IMP为限速步骤，IMP经历积累和快速降解过程[28]，AMP脱氨酶主要催化AMP脱氨生成IMP，本实验结果发现AMP脱氨酶在贮存5 d时含量升高，10 d后下降，可能与IMP变化规律有关。

2.4.5 脂肪代谢相关蛋白

载脂蛋白A-I（apolipoprotein A-I precursor，apoA-I）是高密度脂蛋白中最重要的载脂蛋白。在脂质的摄取、转运以及脂肪代谢调节过程中具有重要作用，作为脂肪传感器来调节脂肪代谢酶的转录[29-30]。本研究发现apoA-I在贮存10 d内没有发生明显降解，但在15 d后含量减少，应该是受脂肪酸代谢影响。

2.4.6 肽链延长与分解相关蛋白

泛素是一种存在于所有真核生物（大部分真核细胞）中的小蛋白，它的主要功能是标记需要分解掉的蛋白质，使其被26S蛋白酶体降解。在贮存前10 d，该蛋白含量没有明显变化，主要是由于三文鱼贮藏过程中生化过程减弱，各蛋白分解作用加强，泛素一直保持活跃状态；贮存15 d后含量明显下降，主要是后期酶和微生物作用导致的。真核细胞延伸因子是一类在蛋白质合成过程中发挥肽链延伸作用的重要分子，只在骨骼肌、心脏和神经元中表达[31]，GO注释表明其主要的分子功能是促进核苷酸结合，与蛋白合成密切相关。该蛋白在贮存初期就发生明显降解，贮存15 d后几乎消失，主要是由于鱼体死后蛋白分解过程加速，合成停止，真核细胞延伸因子生物作用消失，逐渐被内源性酶和微生物分解。

3 结 论

本实验采用iTRAQ技术对0 ℃条件下贮存不同时间的三文鱼新鲜度进行了研究，筛选出28 个可能与三文鱼贮存期间品质变化相关的差异蛋白，并将其分为6 类进行了详细的代谢通路分析。这些蛋白均随着贮存时间的延长发生不同程度的下调和上调，并与鱼体死后僵直和解僵、葡萄糖无氧酵解、细胞器稳定、肌肉收缩和蛋白合成与分解密切相关，因此可以作为研究三文鱼新鲜度变化的潜在差异蛋白。为深入了解0 ℃条件下不同贮存时间的三文鱼品质变化机理提供了一定的参考，下一步可针对代谢产物进行进一步分析，以发现三文鱼品质劣变过程中相关的风味物质变化规律。