艾滋病病毒血浆控制者外周血淋巴细胞亚群分析

张 之，胡海洋，葛 尤，卢 静，周 莹，徐晓琴，邱 涛，傅更锋

0 引 言

艾滋病病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染是一个系统性疾病，表现为CD4+T淋巴细胞进行性降低，其他淋巴细胞亚群亦存在不同程度的异常。部分HIV感染者在不经过抗病毒治疗的前提下，依然能够在5年以上的时间维持较高的CD4+T细胞计数和较低的病毒载量(<2000 copies/mL)，这类人群被称为HIV血浆控制者[1-2]。血浆控制者为研究机体抗HIV的免疫机制提供了模型，已成为世界艾滋病研究领域的热点之一。早期研究将血浆控制者抗HIV 的机制归因于缺陷病毒的感染[3-4]或宿主趋化因子受体多态性(如CCR5-Δ32、CCR2-64I等)[5-6]，但是后来研究发现血浆控制者中具有完全复制能力的病毒株[7]，并且宿主趋化因子受体多态性在不同的人种中也存在着分布不均。上述结果表明病毒基因突变和宿主基因多态性无法完全解释这一现象，宿主免疫系统可能也是血浆控制者抗HIV感染的重要原因之一[8]。

因此，了解血浆控制者体内免疫状况，对揭示其免疫防御机制具有重要意义。但由于血浆控制者样本获得的稀缺性，目前对血浆控制者机体免疫机制的研究仍然较少。有效清除病毒感染细胞需要先天免疫效应和适应性免疫效应的连续活动，这可能与淋巴细胞各亚群均有关联[8]。本研究旨在通过对血浆控制者、慢性感染者以及健康人群外周血淋巴亚群的表达情况进行分析和比较，为进一步研究血浆控制者免疫作用机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集江苏省内艾滋病防治基本信息系统2016年1月至2018年12月29例HIV-1抗体阳性患者。根据患者CD4细胞计数和病毒载量水平分为：血浆控制组[病毒载量≤2000 copies/mL，平均病毒载量(991±887)copies/mL,n=6]、慢性感染组[病毒载量≥2000 copies/mL, 平均病毒载量(52 181±10 180)copies/mL,n=23]，另选取健康人群为对照组(n=70)。6例血浆控制者中3例B亚型，2例BC亚型，1例AE亚型；23例慢性感染者中3例B亚型，14例BC亚型，6例AE亚型。纳入标准： HIV-1抗体确证阳性≥5年，且未经治疗的HIV感染者。排除标准：机会性感染等严重合并症；CCR5△32缺失者。本研究经过江苏省疾病预防控制中心伦理委员会批准(批准号：JSJK-B005-02)，研究对象均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1 仪器和试剂FACS Calibur流式细胞分析仪及配套CD4+T淋巴细胞、NK/B细胞绝对计数荧光抗体试剂购自美国BD公司， Abbott m2000rt荧光定量PCR仪购自雅培公司，配套核酸试剂。

1.2.2实验室检测采集HIV感染者和健康对照静脉血5 mL，采用EDTA抗凝，24 h内完成T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞的绝对计数的流式检测，剩余血样当天离心收集血浆-80 ℃保存，30 d内完成HIV病毒载量检测。

2 结 果

2.1 基本情况3组年龄、性别和传播途径分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表 1 入组研究对象的基本情况

2.2淋巴细胞亚群绝对计数水平的比较血浆控制组、慢性感染组CD4+T 、CD8+T计数明显低于健康对照组(P<0.05)，血浆控制组CD4+T计数明显高于慢性感染者组(P<0.05)，血浆控制组与慢性感染组CD8计数差异无统计学意义(P>0.05)。慢性感染组NK细胞计数、CD4/CD8比值明显低于健康对照组(P<0.05)。血浆控制组与健康对照组B细胞计数、CD4/CD8比值明显高于慢性感染组(P<0.05)。见表2。

表 2 血浆控制者、慢性感染者与健康对照者外周血淋巴细胞亚群计数的比较

2.43组间淋巴细胞亚群之间的相关性血浆控制组外周血CD4+、B和NK细胞计数之间两两呈正相关(P<0.05)；慢性感染组NK与CD4+、B细胞呈正相关(P<0.05)；而健康对照组仅B细胞与CD4+呈正相关(P<0.05)；慢性感染组和健康对照组中CD8+与CD4+细胞呈弱正相关(P<0.05)。血浆控制组各亚群之间的r值高于慢性感染组和健康对照组。见表3，图1。

表 3 血浆控制者、慢性感染者和健康对照外周血淋巴细胞亚群相关系数

a、b、c:血浆控制组； d、e、f：慢性感染组； g、h：健康对照组

3 讨 论

淋巴细胞亚群通过发挥不同功能，在人体免疫功能调节中起到免疫监视效果，并发挥着重要作用，机体免疫状况可以通过淋巴细胞亚群分布反映出来[9-10]。其各亚群之间的平衡状态与机体的免疫功能密切相关。在未经治疗的HIV感染者中，其体内的病毒不断复制，会引起所有主要淋巴细胞群的紊乱，包括B细胞、NK细胞、CD4+和CD8+细胞[11-13]，导致异常的免疫激活。

T淋巴细胞有辅助、杀伤和抑制功能。本研究中，慢性感染者的T淋巴细胞亚群的变化与其他研究结论高度一致[18]，CD4+T淋巴细胞减少，CD8+T淋巴细胞升高，符合HIV感染的一般进程表现。而血浆控制者组虽然也有类似结果，但CD4+T淋巴细胞水平却明显高于慢性感染者，表明CD4+T淋巴细胞的受损程度低于慢性感染者。这可能与调节性T细胞(Treg)表达相对降低有关[20]，也有可能与CAF (CD8+cell antiviral factor)介导CD8+T细胞的非细胞毒性抗病毒反应有关[21]。本研究发现血浆控制者CD4+/CD8+比值低于健康对照但高于慢性感染者，这说明3组间免疫激活程度不同，血浆控制者的免疫激动状态与慢性感染者存在一定差异。此外，有研究表明，具有控制病毒能力的 CD8+CD28+T淋巴细胞的水平在HIV 潜伏感染缓慢降低，虽然 CD8+T 细胞数量仍然高于正常，但其功能却进一步下降[22-23]，这提示我们可以进一步对血浆控制者外周血中CD8+、CD28+T淋巴细胞水平进行研究，探索其升高的CD8+T细胞控制病毒的能力以及对CD4+T细胞的调节功能。另外，T细胞活化水平越高,其凋亡速度也越快[22]，导致 T淋巴细胞的高易感性和易耗竭[24]，血浆控制者T细胞活化程度也值得进一步探索。

B细胞和NK细胞分别是体液免疫和固有免疫的效应细胞。有研究显示在HIV感染中，B细胞的总频率降低，而凋亡诱导的B细胞死亡增加是HIV感染过程中B细胞减少的重要原因[15]。B细胞通过抗原提呈、分泌细胞因子和抗体等功能在免疫系统中发挥着重要的作用[25]。本研究中慢性感染者B细胞数量低于健康人群，而血浆控制者B细胞总数和健康人群无异，且高于慢性感染者，提示血浆控制者B细胞数量并未受损，可能并未出现大量凋亡现象，但是其亚群和功能是否受损，需要进一步的实验验证。HIV感染后，NK细胞也受到一定程度的破坏，其数量和亚群均受到影响。NK细胞是机体防御病毒和肿瘤的天然屏障，它能分泌细胞毒因子和颗粒酶穿孔素而杀伤被感染的靶细胞[13]。本研究结果中慢性感染者NK细胞数量低于健康人群，而血浆控制者NK细胞水平则与健康人群无异，表明血浆控制者NK细胞的功能受损程度低于慢性感染者。

本研究血浆控制者中，CD4+细胞、B细胞和NK细胞之间呈现高度的正相关性，在慢性感染者和健康对照中其相关性或有或弱，提示血浆控制者淋巴细胞亚群之间可能存在积极的相互促进关系。有研究表明，B细胞与CD4+T淋巴细胞存在稳态效应[26]，CD4+T细胞代表T辅助细胞亚群(Th)，具有辅助B细胞及诱导其他细胞亚群的活化的作用，在免疫调节中，对细胞免疫和体液免疫平衡的维持具有枢纽的功能，而 B细胞作为APC也可给CD4+T细胞提供活化和共刺激信号[27]。有学者提出，HIV感染病毒血症者B细胞辅助T细胞活化和增殖的能力比健康人和无病毒血症者更低，而CD4+T细胞活化后通过CD40L辅助B细胞增殖的能力受损[28]。而本次研究结果则间接支持了这一研究结论，健康人群中，CD4+T细胞与B细胞存在一定的正相关；在慢性感染者中，CD4+T细胞活化增殖能力降低，不能有效刺激B细胞增殖，与B细胞计数相关性消失，但是，在血浆控制者中，CD4+T细胞与B细胞高度正相关，意味着CD4+T细胞辅助B细胞增殖的能力比健康人群要强。但是这一推论仍需通过进一步实验研究去验证。血浆控制者中NK细胞与CD4+T细胞、B细胞之间的相互作用机制尚不明确，本研究为观察性研究，不同研究对象的淋巴细胞亚群改变与疾病进程之间的关系只能得出存在相关性的结论，尚无法推论出因果关系，值得更进一步的探索。

目前所有的治疗方法尚无法彻底清除所有病毒，只能达到功能性治愈，即将病毒载量水平抑制在极低的水平。深入了解血浆控制者各淋巴亚群的功能情况及相互作用机制，或将能够探索更优化的先天免疫效应和适应性免疫效应的免疫应答模式，为艾滋病的免疫功能治疗提供新的思路。