神经炎症介导海马γ振荡异常在术后认知功能障碍中的作用

高炟鹏，周志强，张利东，嵇 晴

0 引 言

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是手术麻醉后一种常见的中枢神经系统并发症，主要表现为认知记忆能力受损、注意力和社交能力下降，可持续数周到数月，尤多见于老年患者[1]。研究报道，60岁以上老年人非心脏手术的POCD发生率在术后3个月高达10%[2]。POCD可导致患者术后恢复延迟、生活自理能力下降、术后并发症增加甚至增加患者死亡率，给家庭和社会带来沉重负担[3]。然而，POCD的发病机制仍不清楚[4-6]。本研究探讨神经振荡活性变化在神经炎症介导POCD中的作用，为其防治提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组老年雄性C57BL/6小鼠48只(18～20月龄，26～35 g)，由东部战区总医院比较医学科提供，实验动物合格证号[SCXK(鲁)20160001]，饲养于湿度45%，温度25 ℃，12 h灯照(07:00-19:00)的动物房中，自由摄水，饮水。采用随机数字表法分为对照组、手术组、手术+米诺环素组，每组16只。其中，对照组：不接受麻醉与手术；手术组：仅接受手术；手术+米诺环素组：接受麻醉与手术，并术毕即腹腔注射米诺环素(40 mg/kg)，术后第2、3天每日注射1次，连续3d[7]。每组随机取11只小鼠做行为学实验，另外5只做电生理检测；11只动物行为学实验完成后随机选择其中6只取海马组织检测海马炎症因子。

1.2POCD动物模型建立采用七氟醚麻醉+剖腹探查建立POCD动物模型[8]。小鼠先暴露于2.1%七氟醚+100% O2的麻醉室中30 min后立即进行手术，术中继续给予2.1%七氟烷麻醉维持。在腹部正中剪开约1 cm切口，然后对器官、肠和肌肉组织进行探查。探查完毕采用无菌4-0铬肠线缝合肌肉筋膜和皮肤。术后在伤口涂抹聚卟啉(美国辉瑞公司)以防止感染。对照组小鼠未接受麻醉与手术。

1.3旷场实验旷场实验用于评估小鼠的探索行为和焦虑行为。将小鼠置于40 cm×40 cm×40 cm的敞箱中心，自由探索5 min。记录并分析中央格停留时间和活动总距离(中国上海欣软信息技术有限公司)。每次实验之前，用75%乙醇擦拭敞箱以免气味干扰。

1.4新物体识别实验新物体识别实验用于评估小鼠认知能力。在一个40 cm×60 cm×50 cm的敞箱中进行。第1天为适应，将小鼠放在敞箱中自由探索5 min。第2天，将两个相同的物体放在敞箱中对称的位置，让小鼠自由探索10 min。第3天，将其中一个物体换成颜色和形状完全不同的新物体，继续让小鼠自由探索10 min，使用视频跟踪系统记录。对物体的探索定义为动物的鼻子位于距离≤2 cm的区域内。新物体探索率按以下计算公式：

探索率(%)=新物体探索时间/(新物体探索时间+熟悉物体探索时间)×100%

1.5条件恐惧实验条件恐惧实验用于评估小鼠联想记忆。实验分为训练和测试两部分。把小鼠单独放在实验箱中自由探索180 s，然后给予30 s的声音刺激(70 dB，3000 Hz)，在声音刺激的最后2 s给予足底电击(0.75 mA)。适应30 s后放回原来的笼子里。训练结束后24 h，进行场景性条件恐惧测试(海马依赖性测试)。将小鼠放到原来的试验箱，不给予任何刺激，监测5 min内的僵直时间。2 h后，在一个改变环境及气味的试验箱内进行声音关联性条件恐惧测试(海马独立性测试)。小鼠在实验箱中适应3 min之后给予连续3 min与训练时相同的声音刺激，并记录后3 min内的僵直时间。僵直行为是指除了呼吸以外没有任何运动。

1.6酶联免疫吸附法腹腔注射2%戊巴比妥钠(60 mg/kg)处死小鼠，收集海马，在每100 mg脑组织中加入1 mL 冰等渗盐水研磨使组织变成匀浆。以10 000×g转速低温离心10 min分离血浆。根据说明书，用ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(货号ab208348)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)(货号ab197742)、IL-6(货号ab100712)和IL-10(货号ab108870)的水平(Abcam，中国)。所有样品均进行了重复分析，读数均与标准蛋白质的含量标准化。

1.7场电位记录戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，并用0.5%布比卡因局部浸润麻醉镇痛。将动物固定于脑立体定位仪，眼睛涂上眼部润滑剂。切开皮肤，暴露顶部头骨，使中线和前囟可见。根据小鼠脑图谱，标记海马CA1区电极插入位置(向后 2.1 mm; 侧方1.5～1.7 mm; 深度1.7～2.1 mm)，本研究使用特制模具制作成可植入海马CA1区的4通道微丝阵列电极。用牙科水泥将所有电极绝缘并固定于颅骨表面，缝合头皮。术后3 d给予小鼠腹腔注射青霉素抗感染，单笼饲养，恢复1周。局部场电位采集由Plexon公司(Plexon，Dallas，Tx)生产的多通道数据采集系统完成，采样频率分别为40 kHz和1 kHz，并给予50 Hz干扰排除。

2 结 果

2.1旷场实验与对照组比较，手术组小鼠新物体探索时间、辨别指数与场景关联僵直时间均显著降低(P<0.05)。与手术组比较，手术+米诺环素组新物体探索时间、辨别指数与场景关联僵直时间均显著增加(P<0.05)。各组小鼠在探索总路程、中央区域停留时间与声音关联僵直时间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2小鼠海马炎症介质的比较与对照组比较，手术组小鼠海马IL-1β与IL-6水平显著增高(P<0.05)。与手术组比较，手术+米诺环素组IL-1β与IL-6水平显著降低(P<0.05)。各组小鼠海马TNF-α与IL-10表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3不同环境下场电位比较与对照组比较，手术组小鼠海马CA1区γ振荡均显著降低(P<0.05)。与手术组比较，手术+米诺环素组海马CA1区γ振荡显著增加(P<0.05)。在场景关联环境中：与对照组比较，手术组小鼠海马CA1区γ振荡均显著降低(P<0.05)。与手术组比较，手术+米诺环素组海马CA1区γ振荡显著增加(P<0.05)。见图1。

表 1 小鼠行为学的比较

与对照组比较，*P<0.05;与手术组比较，#P<0.05

表 2 小鼠海马炎性介质的比较

与对照组比较，*P<0.05;与手术组比较，#P<0.05

a:静息状态； b:新物体识别实验； c:场景相关性环境

3 讨 论

随着全球人口老龄化加剧，接受手术的老年患者越来越多，POCD的防治也越发迫切[9]。本研究结果显示：POCD小鼠海马炎症反应增加，γ振荡缺失，而应用米诺环素可以逆转过度炎症反应与γ振荡缺失，从而改善POCD。因而，本研究推测神经炎症介导海马γ振荡异常很可能在POCD中发挥关键作用，可能为POCD的防治提供新的靶标。

POCD是继发于手术后的认知功能改变。流行病学显示POCD与遗传、高龄、术前认知状态、术前合并症、术前用药、外科手术和麻醉药物等有关，但其发病机制仍有待进一步阐述[2]。国内外最新研究均表明：POCD的发生可能是多途径的，与Aβ聚集及Tau蛋白过度磷酸化、中枢炎症反应、细胞凋亡、钙稳态失衡及神经递质传递改变等有关[9]。其中，中枢免疫系统触发炎症反应被认为是POCD发生的关键因素。手术创伤可诱导活化小胶质细胞释放多种炎症介质，如TNF-α、IL-1β、IL-6[10]，后者引起突触结构功能改变和细胞凋亡等现象，最终导致神经细胞功能受损。本研究也显示：在剖腹探查建立的POCD动物模型中，海马IL-1β与IL-6表达显著增加，而米诺环素可以降低IL-1β与IL-6水平并改善小鼠认知功能。我们的研究结果与前人研究结果基本一致，提示中枢炎症在POCD中发挥非常重要的作用[4-6]。然而，中枢炎症是通过何种机制介导POCD的发生仍有待进一步研究。

学习记忆等基本的大脑活动有赖于神经网络正常有效地活动。越来越多的证据表明：γ振荡是神经微环路的一种基本形态且普遍存在于动物和人类皮层、海马以及丘脑等多个大脑区域[11]。γ振荡能够对局部兴奋性锥体神经元提供同步抑制性突触后电位，抑制其节律，并可由快速兴奋的锥体神经元反馈调节和稳定，从而在多种高级脑功能活动中如学习记忆等发挥重要作用[12]。在双相情感障碍的抑郁症患者中，γ振荡出现明显下降[13]。在有记忆损害的阿尔兹海默病患者的脑电图中，其自发的γ振荡及在图片刺激条件下引发的γ振荡均明显降低[14]。这些结果提示γ振荡异常很可能介导POCD的发生。本研究中，我们发现尽管在静息状态下各组动物在各个频段振荡无差异，但在执行认知活动如新事物识别与场景恐惧实验时，手术组动物出现γ振荡受损，而米诺环素可逆转γ振荡异常，并改善认知功能。这些结果提示中枢炎症介导的γ振荡异常在POCD中发挥重要作用。不仅如此，新近文献指出，通过兴奋PV中间神经元诱发的γ振荡能减少阿尔兹海默病动物模型脑内Aβ的产生，从而改善认知功能[15]。

本研究存在不足之处:①我们未使用特异性增强γ振荡的技术，因此本研究未能建立γ振荡与认知功能的因果关系；②鉴于本研究样本量相对较小，研究结果需要更多的研究证实与验证。

总之，本研究结果显示，神经炎症介导海马γ振荡异常很可能在POCD中发挥关键作用，鉴于γ振荡在认知功能执行中的重要作用，对其进行有效干预有望成为相关疾病如POCD的防治新方法。