地塞米松诱导小鼠胚胎腭裂发生中相关差异表达基因的生物信息学分析

郭佳男，刘 涛，何 苇

0 引 言

唇腭裂是人类最常见的先天性颌面部发育畸形之一，该缺陷不仅会影响患儿面容美观、进食吞咽和语音功能，而且会影响患儿的心理和社会交往。临床上根据是否伴有其他系统畸形或先天发育异常将其分为综合征型唇腭裂和非综合征型唇腭裂(non-syndromic cleft lip and/orpalate, NSCL/P)[1]。有报道表明NSCL/P的发病率根据研究对象的地理位置、种族、社会经济地位的差异而略有不同[2]，在国内活产儿中的发病率大约为1.62‰，略高于西方国家1.42‰的发病率[3-4]。

从病因学角度来看，越来越多的证据表明唇腭裂的发生是环境因素和遗传因素共同作用的结果[5]。糖皮质激素(glucocorticoid, GC)是一种常用的免疫抑制剂，有时候临床上孕妇不可避免要使用到GC，但研究发现过量GC可改变胚胎腭的发育过程，进而诱导腭裂的发生[6]。而地塞米松(dexamethasone, DEX)与其他种类GC相比，诱导胚胎腭裂的发生率较高，但胚胎致死率很低，是一种较为理想的腭裂动物建模环境刺激因素[7]。因此，深入解析DEX诱导腭裂发生的作用机制，对于降低NSCL/P的发病率具有重大的研究意义和临床价值，但目前对于DEX导致腭裂发生的机制尚不十分清楚。

之前对于DEX诱导腭裂发生机制的研究都是从单个或少数几个基因水平进行的，缺少基因表达整体观。而RNA测序是近年来快速发展的高通量测序技术，具有信噪比高、分辨率高、应用范围广等优势，能从全局的角度了解基因的表达情况和变化规律，为全面认识基因的功能和基因间的相互关系提供线索[8]。本研究利用RNA测序技术，拟建立DEX导致NSCL/P相关的DEGs变化为线索的调控基因网络框架，并通过对其进行基因功能和信号通路富集分析，探讨DEX干预对小鼠胚胎颌面部组织的基因改变影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组SPF级10周龄、体重20 g以上C57BL/6J野生型小鼠(斯贝福生物技术有限公司，北京)，许可证号：SCXK (京) 2018-0010，光照/黑暗各12 h，自由摄取饮用水及饲料，室温调节至18～25 ℃，相对湿度调节至20%～30%，空调保持通风以减少氨气浓度，定期检查并更换清洁垫料，及时补充饮用水及饲料，并对其生理状况和行为进行监测。DEX(索莱宝公司，北京)；Trizol试剂(Invitrogen，美国)；RNA later(Invitrogen，美国)；SYBR©Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa，日本)；Prime ScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，日本)；引物合成(吉凯基因，上海)。

1.2DEX诱导小鼠胚胎腭裂模型的建立按照何苇等[9]的方法构建模型，17:00将C57BL/6J小鼠按照雌雄比2∶1合笼交配，于次日上午8点检查小鼠孕栓，发现孕栓者标记为胚胎第0.5天(E0.5)。E10.5时按随机数字表法将孕鼠分为DEX组和等渗盐水组，DEX组按照6 mg/kg的浓度腹腔注射DEX(DEX预先溶于等渗盐水中，于E10.5-12.5每天同一时间连续注射3 d)，等渗盐水组则按照同样剂量和同样时间腹腔注射等渗盐水，于E14.5收集样本。

1.3样本的收集与处理颈椎脱臼法处死E14.5孕鼠，剖宫取出胚胎。将DEX组与等渗盐水组各收集9只孕鼠的胚胎颌面中部组织(将小鼠完整头部去除下颌、舌以及眼部之上的脑部组织)，随机将每3只孕鼠的胚胎颌面部中部组织作为一个样本，得到约为黄豆大小组织块，用PBS液清洗干净，放入相当于组织块5倍体积RNA later的离心管中孵育过夜后转入-80℃冰箱保存。

1.4总RNA的提取和质量检测待样本收集完成，使用Bio PulverizerTM冰冻粉碎组织，加 1mL的RNA抽提试剂Trizol，使用Mini-Bead-Beater-16匀浆后抽提RNA。使用Nanodrop公司分光光度计测定RNA在分光度260及280 nm的吸光度值，以保证提取的RNA符合实验要求。RNA测序分析技术服务由上海烈冰科技有限公司提供。

1.5构建RNA文库及深度测序获取符合要求的总RNA后，使用链霉亲和素磁珠从1 μg RNA中提取全部带poly(A)尾的RNA，随机打断成片段，以mRNA片段为模板逆转录成双链DNA，通过末端修复加工双链DNA后进行PCR扩增。PCR产物热变性形成单链，单链DNA环化得到单链环状DNA文库，最后利用Illumina Hiseq 2000测序平台对建好的DNA文库进行50个循环的双端测序。定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)提取E14.5胎鼠腭突mRNA，逆转录为cDNA，qPCR验证4个DEGs(表达升高和表达降低的代表基因各2个)组间表达差异，引物序列如下：LC3引物序列正义链为5′-gcctgtcctggataagacca-3′，反义链为5′-ccgtcttcatccttctcctg-3′；Beclin-1引物序列正义链为5′-ggccaataagatgggtctga-3′，反义链为5′-gctgcacacagtccagaaaa-3′；PCNA引物序列正义链为5′-gtggagcaacttggaatccc-3′，反义链为5′-ggttaccgcctcctcttctt-3′；Cyclin D1引物序列正义链为5′-agaagtgcgaagaggaggtc-3′，反义链为5′-ttctcggcagtcaagggaat-3′。采用96孔板，配制10 μL反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ5 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.2 μL，cDNA 1 μL，dH2O3μL。反应条件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参，采用2△△Ct方法计算各目的基因的相对表达水平。

1.6基因差异表达分析对原始数据用Feature Extraction software 10.7读取后采用Gene Spring Software 11.0进行归一化处理，所用的算法为Quantile。采用Fold-change(FC)法及t检验统计学方法对DEGs进行筛选。挑选条件如下：FC≤0.5或者FC≥2，t检验的检验水准α=0.05。利用筛选差异倍数(FC值)以及t检验得到的P值2个因素共同绘制火山图，再对筛选出的差异基因进行GO及KEGG分析。

2 结 果

2.1DEX导致小鼠胚胎腭裂模型的构建DEX干预后，可见E17.0新生小鼠胚胎腭突发育不足，无法融合导致腭裂发生，而等渗盐水组小鼠腭部正常融合。

2.2差异表达基因的筛选结果原始序列经过处理后，2组样本所获得的可用于分析的基因数量分别平均为23 328个。测序筛选出表达差异大于2倍的基因共有796个，其中有492条表达上调，表达下调的304条。部分差异倍数较大基因见表1，火山图见图1。

表 1 异常表达基因部分结果

红色区域：P<0.05且FC≥2的差异基因；蓝色区域：P<0.05且FC≤0.5的差异基因

2.3差异表达基因的GO功能显著性分析通过对筛选出来的DEGs进行GO功能分析，可知DEGs

主要涉及多细胞有机体发育、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录调控、离子转运、细胞分化和细胞黏附等生物学过程。根据enrich factor值的大小，按降序排列作图，取前20个结果，见图2。

图 2 GO富集图

2.4差异表达基因的通路显著性富集分析将DEGs以P<0.05为筛选条件进行KEGG pathway分析，结果显示DEGs可能涉及PI3K-AKT、Wnt及Hedgehog等信号通路，这与之前的研究结果相吻合。根据enrich factor值的大小，按降序排列作图，取前20个结果，见图3。

图 3 Pathway富集图

2.5q-PCR验证对4条目的基因进行验证，结果显示LC3和Beclin-1基因表达上调，PCNA和CyclinD1基因表达下调。4条DEGs表达上调或下调的变化趋势与高通量测序检测结果一致，提示该测序结果可靠，验证结果见表2。

表 2 qPCR验证各基因相对表达量

3 讨 论

环境因素与NSCL/P发生的相关研究一直局限于单个或少数基因，如Lan等[10]的研究发现，在DEX作用下，小鼠胚胎腭突组织中成骨基因GATA6和BMP2表达水平降低，凋亡蛋白bax和caspase3表达水平升高，表明DEX可以抑制腭突成骨及促进腭突细胞凋亡。Ma等[11]的研究则发现DEX可下调PAR3/PAR6/aPKC的表达,表明DEX可通过抑制小鼠胚胎腭的PAR复合体，干扰内侧缘上皮细胞的PAR复合体和细胞极性，从而导致腭融合失败。但是，这些实验仅仅揭开了DEX诱导腭裂发生机制的冰山一角，目前对DEX诱导小鼠胚胎腭裂的分子机制的认识仍然很不充分。近些年来，已有学者利用RNA测序、关联分析等生物信息学方法来研究DEX干预带来的影响，这些研究涉及血管生成、肝代谢、药物不良反应等多个生理过程[12-14]。然而当前对于DEX诱导NSCL/P的DEGs的整体性研究尚未见报道。而随着高通量测序技术的迅猛发展，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致的全貌分析成为可能。本研究通过高通量测序技术成功筛选到一些与DEX诱导NSCL/P相关的DEGs，为NSCL/P病因的研究提供了新的思路和工作基础。

生物信息学分析方法是当代分子生物学研究的重要工具，它能方便快捷地预测疾病相关mRNAs的功能及通过哪些相关信号通路发生变化，因此可以从立体角度观察多致病因素对疾病发生的影响，对于病因十分复杂的先天性疾病的致病机制研究提供宏观视角。本研究通过RNA高通量测序结合生信分析，筛选出DEX诱导小鼠胚胎腭裂发生中相关DEGs并对其进行功能分类，推测这些基因在DEX诱导小鼠胚胎腭裂发生中的功能和作用。本研究发现DEX组样本中有796个mRNAs呈显著性差异表达，其中492个基因表达水平上调，304个基因表达水平下调。对部分基因的qPCR验证结果也证实了与高通量测序结果相一致的DEGs表达变化。

腭的发育是一个连续且精密的过程，其中任何一步受到干扰都有可能导致腭裂的发生[15]，大量研究发现在此过程中许多细胞表型都可能出现异常，比如细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化及细胞黏附等[16-19]，我们通过对DEX诱导NSCL/P发生相关DEGs进行GO分析显示以上几种生物学过程异常均参与DEX诱导的腭裂发生。同样，NSCL/P的发生发展也涉及到多种信号通路，对任一通路传导障碍的调控都可能对治疗NSCL/P起到重要作用。如Wnt信号通路和Hh信号通路已被普遍认为参与NSCL/P的发生[20-21]，本研究中DEGs所涉及的通路众多，且上述几条重要通路均包含在内。

综上，DEX对小鼠胚胎面中份区域的影响涉及细胞发育、信号传导、分子结合等多个方面，拟为后期进行具体靶标基因的功能验证和调控机制建立前期基础和推测依据。