牛传染性鼻气管炎病毒检测方法研究进展

刘清荣

（山东省诸城市畜牧业发展中心 山东潍坊 262200）

牛传染性鼻气管炎病毒属于疱疹病毒I 型，病牛和带毒牛是主要传染源，牛传染性鼻气管炎病毒可以发生呼吸道和生殖道传播，病毒通过胎盘可以发生垂直传播。此外，病毒可以在体内潜伏在腰、脊神经节或三叉神经节内，带毒牛呈潜伏感染状态，可以长期带毒。不同年龄和性别的牛都可以感染病毒，病牛主要临床表现为鼻气管炎、脑膜脑炎，孕牛流产，产死胎，子宫内膜炎和乳房炎，肠炎等，牛传染性鼻气管炎病毒危害巨大，只有加强牛传染性鼻气管炎病毒的实验室检测才能有助于疾病的早期诊断和防治，牛传染性鼻气管炎病毒的实验室检测方法主要有下面几种。

1 PCR 检测方法

PCR 方法是最常用的分子生物学技术，通过设计特异性检测引物实现核酸片段的体外扩增，是动物疾病检测特异、敏感、准确的检测方法。徐娜等[1]建立了牛传染性鼻气管炎病毒双重PCR 检测方法，该方法根据GenBank 中公布的牛传染性鼻气管炎病毒gE 和gB 基因序列设计2 对特异性检测引物，预期扩增片段大小分别为112 和78bp，该检测方法特异性强，对牛支原体、牛副流感病毒3 型、牛病毒性腹泻病毒、巴氏杆菌、牛和羊布鲁菌检测结果均为阴性，gB 引物最低检测浓度为2.3×103拷贝/μL，gE 引物最低检测浓度为2.4×103拷贝/μL，该检测方法重复性好，可以用于牛传染性鼻气管炎病毒野毒株感染和gE 基因缺失疫苗株的鉴别诊断。

2 荧光定量PCR 检测方法

荧光定量PCR 是更加敏感特异的PCR 检测方法，张颖慧等[2]建立了牛传染性鼻气管炎病毒恒温隔绝式荧光PCR 检测方法，该检测方法特异性好，对牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛副流感3 型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛腺病毒3 型、牛冠状病毒、牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的检测为阴性，敏感性高，检测下限为2.4 拷贝/μL 质粒标准品，检测过程时间短，利用病毒基因组试剂盒仅需1h 就能出结果，通过对9 个省29 份商品化冻精检测，牛传染性鼻气管炎病毒阳性率为24%，说明商品化冻精中牛传染性鼻气管炎病毒感染率较高，应该引起广泛关注，该检测方法可以用于牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测。

3 LAMP 检测方法

LAMP 检测方法是一种可视化、快速、特异的检测方法，特别适合于基层和现场临床样品的快速检测。董世娟等[3]建立了牛传染性鼻气管炎可视化LAMP 检测方法，该方法根据牛传染性鼻气管炎病毒的保守序列gB 基因设计3 对LAMP 检测引物，通过对反应体系的优化和特异性试验及敏感性试验建立了牛传染性鼻气管炎可视化LAMP 检测方法，最适反应条件为65℃、50min 条件下扩增反应，根据颜色变化判定结果。该方法的检测下限为10 拷贝/μL 的质粒DNA，敏感性比普通PCR 方法高很多，对牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、水泡口炎病毒等没有交叉反应，应用该方法检测393 份临床样本，301 份鼻腔拭子阳性率为87.6%，92 份血清样本阳性率为58.8%，表明鼻腔拭子的检出率更高，更适合临床采样，该检测方法可以用于牛传染性鼻气管炎病毒的基层和现场临床样品的快速检测。

4 胶体金检测方法

胶体金检测方法具有简便、快速、灵敏、稳定、特异、结果易判等诸多优点。梅力等[4]制备了牛传染性鼻气管炎病毒抗体胶体金检测试纸条，该试纸条采用杆状病毒表达系统表达牛传染性鼻气管炎病毒gD 蛋白抗原，将gD 蛋白纯化后用胶体金标记作为示踪抗原，未标记的gD 蛋白抗原作为捕获抗原，羊抗牛IgG 抗体作为质控抗体，制备了牛传染性鼻气管炎病毒双抗原夹心法胶体金检测试纸条，该试纸条特异性好，灵敏度高，与牛口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒等阳性血清无交叉反应，与IDEXX 牛传染性鼻气管炎病毒抗体ELISA 检测试剂盒的阳性符合率为93.5%，可以用于牛传染性鼻气管炎病毒抗体的临床诊断和检测。

5 结语

牛传染性鼻气管炎病毒是一种以呼吸道症状为主的病毒性传染病，传播迅速，对养牛业危害巨大，该病目前没有特效治疗药物，只有加强疫苗免疫和疾病的快速诊断和隔离淘汰才是控制本病流行的最好方法，因此，建立快速的疾病诊断方法对防控本病至关重要，实际应用中可以根据需要综合运用各种实验室检测方法，更好的控制牛传染性鼻气管炎病毒的传播和流行。