甘油预处理蔗渣的木质素分离提取及结构表征

曾诚，宋国杰，孙海彦，郭书贤，孟超然，孙付保

（1 江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口571101；3 南阳理工学院生物与化学工程学院河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南南阳473004）

在环境挑战和能源安全的压力下，社会正在迫切寻求可再生的碳中性资源，用于生产生物基材料、化学品和生物能源。木质素是仅次于纤维素的第二大天然高分子，也是自然界中唯一能提供可再生芳香族化合物的非石油资源。造纸工业每年要从植物中分离出大约14 亿吨纤维素，同时得到5000万吨左右的木质素副产品[1]。但目前只有不到2%的木质素被用于高附加值产品的生产，超过95%的木质素以造纸废水的形式直接排入江河或浓缩后烧掉[2]。这种天然有机物不仅没有得到有效利用，还造成了严重的污染。因此，对木质素的分离提取和结构研究显得尤为重要。

本实验室在前期利用甘油建立的预处理方法取得了良好的预处理效果[3-4]，其中常压甘油自催化预处理（AGO）能使甘蔗渣中的木质素脱除率达到65%以上，纤维素保留率高于95%；常压甘油碱催化预处理（al-AGO）能使甘蔗渣中的木质素脱除75%以上，纤维素保留率高于85%。截至目前，采用甘油预处理进行木质素提取具有以下几点优势：①甘油木质素具有纯度高、分子量小且分布窄、活性基团丰富等特点，具有较高的工业价值；②甘油热敏性好（比热容不足水的60%），温度可控性高；③基质适用强，可广泛应用于各种农林生物质原料；④属于木质素选择性溶解型，木质素脱除率高；⑤甘油渗透性好，它能渗透到细胞内以羟基和胞内大分子形成氢键，使碳水化合物保持原有结构；⑥甘油预处理过程中几乎不产生糠醛类抑制物（＜1g/kg 原料）[5]。但是，对于脱除在溶液中的木质素研究甚少。怎样将木质素最大化提取出来，以及研究其具有哪些结构特征成为亟待解决的问题。

木质素是由苯基丙烷结构单元，即松柏醇、芥子醇和对香豆醇，经过氧化偶合形成的天然酚型高分子聚合物[6]。在进行脱木质素的过程中，木质素往往伴随着解聚和缩合反应的发生。木质素苯基丙烷结构单元间的主要连接类型包括β-O-4'、β-β'、β-5'等[7]。另外，除了结构单元之间的连接外，木质素与碳水化合物之间还存在交联，主要连接类型有苄基醚键、苄基酯键和苯基糖苷键等[8]。其中，禾本科植物原料的木质素主要通过阿魏酸与碳水化合物产生交联[9]。

本文利用甘油对甘蔗渣分别进行AGO 和al-AGO预处理后，对溶于溶液中的木质素进行提取，分别得到自催化甘油木质素（AGOL）和碱催化甘油木质素（al-AGOL）。采用单因素实验和正交实验对提取方法进行优化，以期提高木质素的得率。另外，通过对木质素结构进行表征分析来研究木质素在预处理过程中所发生的结构变化。

1 实验部分

1.1 原料与试剂

甘蔗渣（华南理工大学提供）使用前过1mm筛网，并在105℃下烘干至恒重。其主要组分含量：纤维素39.2%，半纤维素18.8%，木质素22.4%。工业甘油（纯度约99.5%）购自无锡化工站。盐酸、二氧六环、氢氧化钠、乙酸等均购自国药集团有限公司。

1.2 方法

1.2.1 木质素的制备

采用常压甘油自催化预处理方法（AGO）将100g 甘蔗渣与1000g 甘油混合加热至220℃保温2h后，加入250mL 热水进行冷却，待温度下降至80℃左右后，用G1砂芯漏斗抽滤实现固液分离，收集过滤的液体（此时滤液的甘油浓度为80%）和残渣。在滤液中加入大量酸水（用6mol/L HCl调去离子水pH 为2，后文中的酸水都是用相同的方法配制而成），使木质素沉淀得到AGOL。此时预处理后残渣质量为72g，残渣组分为纤维素53.5%、半纤维素15.1%、木质素17.9%。

采用常压甘油碱催化预处理方法（al-AGO）将100g 甘蔗渣、1000g 甘油及0.1%的NaOH 混合，在240℃下保温10min。后面的操作与上述相同，得到木质素al-AGOL。此时预处理后残渣质量为65g，残渣组分为纤维素54.3%、半纤维素24.1%、木质素10.1%。

球磨甘蔗木质素（milled bagasse lignin，MBL）的获得参照文甲龙等[10]的方法进行。在本文中MBL作为对照品用于结构表征分析的比较。

1.2.2 木质素提取的优化

（1）单因素的选择 由于al-AGO比AGO的脱木质素效果更好，木质素提取工艺的优化建立在预处理方法al-AGO 上进行。以木质素提取率为评价指标进行单因素选择。基础木质素提取条件为：转速8000r/min、离心时间为5min、甘油混合液pH为2、甘油混合液浓度为20%。选择单因素实验时分别考察离心转速（2000r/min、4000r/min、6000r/min、8000r/min、10000r/min）、离心时间（3min、5min、10min、15min、20min）、甘油混合液pH（2、3、4、5、6）、甘油浓度（10%、20%、30%、40%、50%、60%）对结果的影响。每个实验离心结束后，去除离心管中的上清液，并用清水清洗剩余固体两次，保留离心管中的固体。将装有固体的离心管置于105℃下烘至绝干，利用差重法，得出每个实验所提取的木质素质量，木质素提取率的计算公式见式(1)。

（2）正交实验优化 在单因素实验的基础上，设计正交实验研究木质素工艺条件对木质素提取率的影响。以离心转速（A）、离心时间（B）、甘油混合液pH（C）、甘油混合液浓度（D）四个因素为变量，选用L9(34)正交表设计4因素3水平正交实验。每个实验离心结束后，倒掉离心管中的上清液，并用清水清洗剩余固体两次，保留离心管中的固体。将装有固体的离心管置于105℃下烘至绝干，利用差重法计算出每个实验所提取的木质素质量。正交实验设计及变量水平见表1。以上每个实验平行进行三次，实验结果取其平均值，实验误差在5%以内。

1.2.3 木质素的纯化

将提取得到的木质素按照固液比1∶20(g/mL)溶于90%的乙酸溶液中，再将该乙酸溶液滴入10倍体积的酸水中，再用酸水洗涤三次，离心冻干得到纯化木质素[11]。将经过纯化的木质素用于后续的表征分析。

表1 正交实验设计及变量水平

1.2.4 木质素的表征

使用冷场发射扫描电子显微镜（SU882，日本）在放大10000倍的条件下对木质素样品进行观察。木质素分子量根据Li等[12]的方法进行测定：将木质素样品（该样品不需要进行乙酰化处理）溶解在四氢呋喃（THF）中，配制成浓度约为2.0mg/mL的溶液，并用0.45μm 的滤膜过滤后注射进样；以THF 作为洗脱液，流速为1.0mL/min，并使用聚苯乙烯标准物质校准色谱柱，在示差折光检测器（RID）的高效液相色谱（HPLC）Agilent 1260装置上进行测试。采用UH-5300 型分光光度计对木质素样品进行紫外全波长扫描，具体方法参照文献[13]。核磁共振氢谱测定：取15mg木质素样品溶于0.5mL 氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）中，在60℃下进行核磁共振波谱分析（AV Ⅲ400MHz 液体核磁共振波谱仪，Bruker 公司）[14]。热重分析：取8～10mg样品加入热重分析仪（DSC Q2000）中进行热稳定分析，在N2气氛中以10℃/min 的速率升温，测量范围为30～600℃[15]。抗氧化活性测定根据文献[16]进行测量。

2 结果与讨论

2.1 木质素提取工艺的优化

（1）离心转速的选择 离心转速对木质素提取率的影响见图1。由图可见，木质素的提取率随着离心转速的提高而不断增加；当转速为8000r/min时，得到的木质素提取率达到最高值66.7%，再提高转速对木质素提取率的影响不大。因此，实验选择离心转速为8000r/min。

（2）离心时间的选择 离心时间对木质素提取率的影响见图2。当离心时间小于10min 时，木质素提取率随着离心时间的延长而增加；当离心时间大于10min时，木质素增加量很小。因此，实验选择离心时间为10min。

图1 离心转速对木质素提取率的影响

图2 离心时间对木质素提取率的影响

（3）甘油混合液pH 的选择 文献报道显示，降低造纸黑液的pH 能使木质素沉淀下来。因此，本实验考察了甘油混合溶液pH 对木质素提取率的影响。如图3 所示，木质素的提取率随着溶液pH 的下降而增加。当溶液的pH 为3 时，木质素提取率最大，可达到71.8%。继续降低甘油混合液pH 至2 时，木质素提取率变化不大，反而略微减小。这是由于在木质素酸沉过程中，带正电的木质素转变为不溶于水的带负电的酸析木质素。随着pH 的降低，酸析木质素增多，依靠电性引力，酸析木质素吸附带正电的木质素，析出颗粒逐渐增大，酸化体系的黏度增大。整个酸化体系逐渐呈黏糊状，并可吸附大量的水分。当酸化达到一定的pH 后，大部分带正电的木质素转变为酸析木质素时，由于电性斥力，体系的黏度逐渐减小，酸析木质素成为松散的大小不同的颗粒状沉淀，利于后续木质素清洗，易将杂质去除，造成木质素提取率略微下降，这与代琛等[17]的研究结果一致。因此，实验选择甘油混合液pH 为3。

图3 溶液pH对木质素提取率的影响

（4）甘油混合液浓度的选择 甘油混合液浓度对木质素提取率的影响见图4。为了使木质素沉淀下来，最简单的方法就是加水使甘油浓度下降，从而使不溶于水的木质素沉淀下来。由图4可以看出，随着加水量的增加，溶液体系中的甘油浓度不断下降，木质素提取率也不断增加。当溶液体系中甘油浓度为20%时，木质素提取率为69.9%，接近最大值。继续降低甘油浓度对木质素提取率的影响不大。因此，选择甘油浓度为20%较好。

图4 甘油浓度对木质素提取率的影响

（5）正交实验优化结果 在上述单因素实验的基础上，利用正交实验研究工艺条件对木质素提取率的影响。以离心转速(A)、离心时间(B)、甘油混合液pH(C)、甘油混合液浓度(D)四个因素作为考察变量，选用L9(34)正交表设计4 因素3 水平正交实验，实验设计及结果见表2。

根据表2中正交实验结果及实验结果的极差分析可知：木质素提取率影响因素的主次为C＞A＞D＞B，较优参数组合为A3B3C2D1。木质素提取最佳工艺条件为：转速8000r/min、离心时间15min、甘油混合液pH 为3、甘油混合液浓度10%。在此提取条件下，对使用al-AGO 预处理方法后的总滤液中的木质素进行提取，其提取率达到76%。将此种木质素提取工艺方法用于经AGO 预处理后的滤液中的木质素进行提取，其提取率达到72%。

表2 正交实验设计及实验结果

2.2 木质素结构表征

2.2.1 木质素的扫描电镜

为了观察木质素MBL、AGOL和al-AGOL的表面形态，利用SEM 对这些木质素进行表征。SEM图像如图5所示，这三种木质素主要呈现球形颗粒状，这与黄阳等[18]的报道一致。AGOL 和al-AGOL与MBL 相比，在形态大小上更加均一。另外，球形木质素有疏松和亲水性网络结构的基体，具有表面积大、通透能力和水力学性能好等优点，适合于工业化、大规模的床式（固定床、移动床和流动床）吸附处理的需要[19]。后续可以将木质素用于改性，增强它的形状稳定性，使其不易发生变形，以此来制造球形木质素吸附剂。

2.2.2 木质素样品的元素分析

表3 给出了元素分析结构和活性官能团的数据。由表3 可知，MBL、AGOL 和al-AGOL 主要由C、H 和O 三种元素组成，并且它们的含量相差很小。有趣的是，在MBL中含有少量的N元素和S元素。有文献显示，这两种元素来自于蛋白质。而在AGOL 和al-AGOL 中，S 的含量为0，可能是在甘油预处理中，由于反应比较剧烈，而S 含量又少，使得在分离纯化的过程中S被除尽。

表3 木质素的元素分析

2.2.3 木质素样品的分子量分析

木质素样品的重均分子量（Mw）和数均分子量（Mn）通过凝胶色谱来测定。由表4得，MBL的分子量为5717g/mol，而AGOL 和al-AGOL 的分子量分别为2028g/mol和2325g/mol，MBL的分子量将近是AGOL 和al-AGOL 分子量的2倍多。这表明不论在AGO还是al-AGO预处理中，木质素大分子都会发生降解，通过解聚断裂形成木质素片段，造成al-AGOL 和AGOL的分子量相对较小。另外，MBL的分散系数为2.05(＞2)，这与传统MBL 的分散系数(＞2)一致，而AGOL和al-AGOL的分散系数分别为1.47和1.46(＜2)。这说明AGOL和al-AGOL相较于MBL 有着更窄的分子量分布，均一性更高。在生物精炼中，木质素的分散系数是一个重要的参数，低分散系数意味着更加好的生物化学稳定性，具有更广泛的的应用[20]。因此，从甘蔗渣中提取得到的AGOL和al-AGOL有潜力成为一种重要的工业原料。

图5 木质素样品的扫描电镜照片

表4 木质素样品重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)及其多分散度系数(Mw/Mn)

2.2.4 木质素紫外光谱分析

图6 木质素样品的紫外光谱图

由图6 所示，在木质素MBL 的紫外光谱图中，最大吸收峰在315nm附近，说明此木质素跟其他草类木质素一样，在侧链含有较多的不饱和羰基。另一个吸收峰在250nm，这是由共轭双键的π→π*跃迁产生的K 吸收带[21]（非封闭共轭体系的π→π*跃迁产生的特征带）。此外，在280nm 处的肩峰是芳香族化合物B 吸收带的特征吸收[21]。与MBL 相比，AGOL和al-AGOL 的最大吸收峰均出现在280nm左右，峰形较宽，并且有向短波长方向移动的趋势。这可能是由于木质素经过AGO 和al-AGO 预处理后，木质素中的愈创木基较紫丁香基破坏得更多，AGOL和al-AGOL中紫丁香基单元的相对含量较高所致[22]。此外，AGOL 和al-AGOL 在315nm 处的肩峰大幅度减弱，这表明在经过甘油预处理后，木质素中酚基以及与芳香环共轭的C==C 和Cα==Cβ被大量破坏。

2.2.5 木质素样品的1H谱分析

一维氢谱（1H NMR）核磁共振分析如图7 所示，根据文献将各信号峰进行归属[23-24]，如表5 所示。在MBL谱图中，化学位移7.2～7.5、6.8和6.2～6.4分别表示H型、G型和S型木质素芳香环上的质子信号，而β-5'结构中的Hα、β-O-4'结构中的Hβ、β-β'结构中愈创木基Hβ分别对应化学位移在5.2～5.3、4.8～4.9、4.2～4.4之间的信号峰。位于3.8处的尖锐吸收峰为甲氧基的质子吸收峰，溶剂峰DMSO出现在2.5处。此外，2.0～2.3表示甲基或者羰基上的质子，0.7～1.5是脂肪族官能团上氢原子的信号。与MBL 相比，木质素AGOL 和al-AGOL 具有相似的1H 谱吸收谱图，但各信号峰的吸收强度发生变化。通过观察6.2～6.8 范围内吸收峰强度的变化，发现AGO 和al-AGO 都会破坏木质素大分子中的G型和S 型单元。尤其是在al-AGOL 的1H 谱图中，表示G 型单元和S 型单元的信号峰减弱得更加明显，其中表示S 型单元的信号峰没有检测到。另外，木质素中的主要连接结构β-5'、β-O-4'和β-β'也发生部分断裂，其相应吸收峰的吸收强度均有所减弱。

图7 木质素样品的1H核磁共振谱图

表5 木质素的1H NMR信号的主要归属

2.2.6 木质素的热重分析

为了探究各木质素样品的热重性能，利用热重分析仪进行了考察。如图8所示，在热降解的最初阶段（200～350℃），MBL 的热降解率较al-AGOL和AGOL大，说明了在木质素降解的最初阶段，主要涉及β-O-4'的降解，而此时的热降解速率主要取决于木质素中β-O-4'含量的多少。在后续的热降解阶段（350～400℃），木质素的降解速率主要取决于木质素侧链的氧化（羰基化、羧基化和脱氢反应等）。而当降解温度高于400℃时，主要是木质素芳环的降解，主要发生芳环饱和C—C 键断裂和木质素降解为水、二氧化碳和一氧化碳等。同时，甲氧基的裂解主要发生在400～600℃。此外，al-AGOL、AGOL和MBL木质素在600℃的残炭率分别为39.6%、40.4%和26.3%。木质素的热稳定性可以通过木质素的最大失重率（DTGmax）来表示，al-AGOL、AGOL 和MBL 的DTGmax分 别 是388.9℃、376.6℃和365.1℃。在经过甘油预处理后，木质素的最大失重率升至高温区域，说明了更稳定的C—C单元，如缩合单元在处理后含量增加。

图8 木质素的热重分析结果

2.2.7 木质素的抗氧化活性分析

为了比较各木质素的抗氧化活性大小，进行了木质素清除DPPH 自由基的实验。如图9 所示，木质素al-AGOL在浓度为250mg/L时抗氧化活性达到最大，此时自由基清除率为85.4%。而木质素AGOL、MBL 分别在浓度为300mg/L 和450mg/L 时达到最大值，其自由基清除率分别为83.2%和57.6%。三种木质素相比较而言，木质素al-AGOL的抗氧化活性最高，AGOL 次之，MBL 最差。另外，有研究表明，木质素添加量与抗氧化效果不总是正相关，三种木质素的自由基清除率在相应浓度达到最高值后，再提高木质素浓度，其自由基清除率均有所减小。可能是过高的木质素浓度会使得木质素间发生团聚，降低了木质素表面酚羟基与DPPH 自由基接触的概率，使得反应活性位点减少，造成自由基清除效果变差。综合来看，抗氧化活性最高的木质素al-AGOL 有潜力作为抗氧化剂而得到应用。

图9 木质素的抗氧化活性分析

3 结论

（1）实验通过单因素和正交实验优化建立木质素最佳提取工艺为：转速8000r/min、离心时间15min、甘油混合液pH 为3、甘油混合液浓度10%。在该条件下AGOL和al-AGOL 提取率分别达到72%和76%。

（2）各木质素样品经过一系列表征技术分析比较，实验发现MBL、AGOL和al-AGOL的形态均类似于球形；在AGO和al-AGO预处理过程中，木质素中的主要连接键β-5'、β-O-4'和β-β'均会发生断裂，导致木质素片段从亲本木质素大分子中脱离出来，造成AGOL和al-AGOL的分子量变小。热重分析和抗氧化活性分析显示，al-AGOL 的性能最好，AGOL次之，MBL最差。

（3）本文的研究结果为将来的木质素高值化利用提供相关理论和技术支持，具有优良特性的甘油木质素有潜力在工业应用上发挥重要作用。