染料改性胆红素吸附膜的制备

鞠佳，孔鹏飞，封瑞江，梁飞雪，张晓欣，贺高红，杨磊

（1 辽宁石油化工大学石油化工学院，辽宁抚顺113001；2 大连理工大学化工学院，精细化工国家重点实验室，辽宁大连116024）

胆红素是血红蛋白的降解产物，当肝脏受损或代谢受阻时，体内胆红素迅速升高，严重时将对人体的神经系统造成损伤[1-2]。临床降黄有很多方法，如药物治疗、手术治疗、介入治疗等，但是当器官移植的术前术后，人体不能进行正常地代谢，临床通常采用血液灌流直接吸附去除高浓度胆红素。目前血液灌流临床主要采用聚合物微球或颗粒吸附剂[3-5]装填成柱，但是因其扩散路径长、阻力大、饱和吸附量较低，在一定程度上存在治疗时间长、吸附效率低、治疗费用高等问题。许多研究者发现无机纳米材料例如碳纳米管[6]显示出较一般聚合物材料更高的胆红素吸附量，但是直接采用粉体形式的无机纳米材料装填吸附柱存在吸附剂粉体随血液循环泄漏的可能，其血液相容性有待提高[7]。

亲和膜作为一种可选择的血液灌流吸附材料，可有效克服粉体或颗粒吸附剂在传质上的限制，减少了泄漏的可能。与颗粒或者粉体材料相比，亲和膜具有扩散路径短、阻力小、液体通量较大等特点[8]，因此采用亲和膜作为吸附材料可以显著缩短治疗时间，减少治疗时间长带来的痛苦。为了进一步提高亲和膜的传质效率，可以通过共混无机纳米材料制备有机无机共混亲和膜[9]。另一方面，还可以通过接枝特异性配基增强亲和膜的选择性和特异性[10-14]，实现胆红素的高效吸附与分离[15-16]。石巍等[17]以尼龙膜为基膜，将亲水性物质羟乙基纤维素和壳聚糖共价键合在膜上，再采用多种活化试剂将聚赖氨酸固载在膜上，制备出了用于吸附胆红素的亲和微滤膜。乙酸纤维素/聚乙烯亚胺共混微滤膜（CA/PEI膜）是一种新型的胆红素吸附膜，不但对游离胆红素具有较好的吸附效果，而且具有较好的血液相容性[18]，但是其血清中胆红素吸附量明显降低。CA/PEI膜因共混聚乙烯亚胺（PEI）含有较多伯、仲胺基，能够与许多基团在较温和的条件下发生反应[19-20]，使进一步改性接枝配基制备出特异性吸附胆红素的亲和膜成为可能。

配基的选择对于提高亲和膜的胆红素吸附量尤为重要[21-22]。活性染料作为亲和膜改性的通用性配基[22-26]，由于具有氯等反应基团，能够直接与羟基、氨基、巯基等进行反应，常被应用于材料的亲和改性[27]。活性染料汽巴蓝F3GA（CBA）结构如图1 所示，含有苯环和氨基等基团，能够通过静电、氢键、疏水相互作用等吸附胆红素。有研究显示接枝CBA 配基能够提高亲和吸附材料在血清或血浆中的胆红素吸附量[28]。Bayramoglu 等[29]以甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）和甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）为单体制备丙烯酸水凝胶共聚物膜，将PEI接枝到膜表面，再将CBA共价固定在膜上，用于吸附血清中的胆红素，改性膜的吸附量提高了13.8倍。

图1 汽巴蓝F3GA分子式

本论文依据胆红素结构特点选择了CBA 活性染料作为配基，通过上染、固色、清洗等步骤制备CA/PEI-CBA 膜。首先，利用XPS 和ATR-FTIR 分析了CA/PEI-CBA膜化学和元素组成，其次通过正交实验和单边实验研究了染料改性膜的制备条件反应温度、反应时间、CBA 浓度对其胆红素吸附量的影响。由于固色步骤需在高于环境温度、强碱性条件下进行，这可能对CA/PEI 膜的多孔结构有一定的影响，因此正交实验同时考察了制备条件对膜失重率的影响。

1 实验部分

1.1 实验材料及设备

乙酸纤维素（CA），HB-105，美国Hoechst Celanese 公司；聚乙烯亚胺（PEI），50%水溶液，Mn=60000，伯、仲、叔胺比为1∶2∶1，美国Sigma 公司；多异氰酸酯（主要成分二异氰酸酯MDI），工业级，美国罗门哈斯公司；水合茚三酮，天津市大茂化学试剂厂；胆红素，Acros Organics，美国；人血白蛋白（HA），20%溶液，西班牙基立福；汽巴蓝F3GA（CBA），美国Sigma公司。

UV-7504 PC 紫外可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司；THZ-82（A）恒温水浴振荡器，江苏金坛市科析仪器有限公司；ATREQUINOX55傅里叶变换红外光谱仪，德国BRUKER OPTICS 公司；Hitachi-S-4800场发射扫描电子显微镜，日本日立公司；Kratos Axis Supra X 射线光电子能谱仪，日本岛津公司。

1.2 CA/PEI-CBA膜的制备及表征

CA/PEI 膜的制备：CA/PEI 膜是通过乙酸纤维素与聚乙烯亚胺共混、交联、水蒸气诱导干湿相转化法等步骤制备而成[30]，本文按照CA/PEI 共混质量比为13.3，MDI/PEI 的交联质量比为0.5 的较优比例制备CA/PEI膜。

CA/PEI-CBA 膜 的 制 备：CA/PEI-CBA 膜 通 过上染、固色、清洗等主要步骤制备完成。首先配制浓 度 为0.2～10mg/mL 的CBA 水 溶 液20mL，将40mg 的CA/PEI 膜浸入到染料溶液中，加入一定量NaCl 固体，使溶液中NaCl 的质量分数为30%，在80℃下恒温0.5h；再加入一定量Na2CO3固体，使溶液中Na2CO3的质量分数为25%，在30～80℃温度下恒温反应1～5h，取出即为CA/PEI-CBA 膜；经热水、甲醇、缓冲溶液等步骤的清洗，干燥保存。

傅里叶变换衰减全反射红外光谱仪（ATR-FTIR）分析：取CA/PEI-CBA 膜或CA/PEI膜，通过ATREQUINOX55 傅里叶变换红外光谱仪测定，波数范围为500～4000cm-1，分辨率4cm-1，扫描16次。

扫描电镜（SEM）观察：取CA/PEI-CBA 膜或CA/PEI 膜，用液氮冷冻断裂制样，用双面胶黏在SEM样品台上，镀金，最后通过Hitachi-S-4800场发射扫描电子显微镜观察其微观结构，放大倍数为500或10000倍。

X 射线光电子能谱仪（XPS）测试：将CA/PEI-CBA 膜或CA/PEI 膜剪成1cm×1cm 的小方块，采用日本岛津公司的Kratos Axis Supra 型X 射线光电子能谱仪进行XPS测试。XPS能谱仪使用功率为72W的单色化的Al Kα射线源，检测器与样品表面的角度为90°，宽谱与窄谱的收集通能分别为100eV、30eV，扫描步长分别为1eV、0.1eV。

膜的失重率测定：取直径为φ14cm 的CA/PEI膜的膜片若干，经干燥后称量质量为ω0，浸入浓度为0.2～5mg/mL 的CBA 溶液，按照前文所述上染、固色、清洗等步骤制备出CA/PEI-CBA 膜，50℃经干燥后称量质量为ω1，膜的失重率δ可由式(1)计算。

1.3 正交实验

CA/PEI-CBA 膜制备的条件因素主要有反应温度（A）、反应时间（B）和染料浓度（C）。本文选取以上3 个因素在4 水平下考察对CA/PEI-CBA 膜制备和胆红素吸附的影响，故选用正交表L16(45)进行实验安排，其因素水平见表1。

表1 CA/PEI-CBA膜制备条件的因素水平

1.4 胆红素吸附实验

模拟血清溶液的配制：准确称取一定量的胆红素，溶于5mL 0.1mol/L氢氧化钠水溶液中，再加入20%的人血清白蛋白（HSA）使胆红素和白蛋白的摩尔比为1∶1，缓慢摇动，充分溶解后，用去离子水定容，配成浓度为0.05～0.1g/L的胆红素溶液。

静态吸附：称取约20mg CA/PEI-CBA 膜，浸入装有10mL 模拟血清溶液（人血白蛋白与胆红素摩尔比为1∶1）的小瓶中，小瓶经密封、避光处理后，在37℃恒温条件下以170r/min 转速振荡2h。等量无膜的模拟血清溶液作为空白样，在相同条件下进行振荡[21]。胆红素浓度的测定采用改良J-G重氮法，在600nm 波长下使用紫外-可见分光光度计测定[31-32]。胆红素吸附及检测实验均在避光条件下进行。

模拟血清溶液中的亲和膜的胆红素吸附量可由式(2)计算。

式中，q为单位质量的膜上吸附胆红素的量，mg/g干膜；C0和Ce分别为空白样的胆红素浓度和吸附时间t后吸附样中胆红素的浓度，mg/L；V为吸附体积，L；m为膜片的质量，g。

2 结果与讨论

2.1 CA/PEI-CBA膜的表征

图2 绘制了在CBA 浓度5mg/mL、固色反应温度80℃、固色反应时间4h条件下，制备的CA/PEICBA 膜 的ATR-FTIR 光 谱 图，CA/PEI-CBA 膜 在3300～3500cm-1处吸收峰强度增加，此峰与CBA谱图中的伯氨基峰相对应，它的增强可能归因于CBA 在CA/PEI 膜上的担载。与CA/PEI 膜的红外谱图相比，CA/PEI-CBA 膜在1228cm-1处和1744cm-1处的强吸收峰的峰强几乎消失，这可能是因为在碱性、高温的制备条件下，改性膜中的乙酸纤维素发生了酯基水解，将在2.3节进行详细说明。

图2 CA/PEI-CBA膜的ATR-FTIR谱图

为了进一步验证CBA 的担载情况，利用XPS对CA/PEI 膜和CA/PEI-CBA 膜的表面元素组成进行分析，其结果如图3所示。从图3(a)中可以看出，CA/PEI 膜在结合能为284.7eV、399.4eV、532.4eV处有吸收峰，分别对应C1s、N1s、O1s，而CA/PEI-CBA 膜在结合能为167.8eV 处新观察到S2p峰。CA/PEI-CBA 膜S2p 峰分峰处理结果如图3(b)所示，图3(b)显示在结合能等于167.4eV和167.8eV处出现的吸收峰为S==O 和—SO3H 的S2p 峰[33]，证明因接枝CBA分子（图1）膜上增加了含硫的磺酸基团。表2 的数据显示，改性后N 元素含量由5.49%增加至8.74%，说明在引入磺酸基团的同时引入了氨基，表明CBA 分子在CA/PEI 膜上成功担载。

2.2 CA/PEI-CBA膜制备条件的优化

为了优化染料改性膜的制备条件，以胆红素吸附量为考察指标，因素A、B、C的正交实验安排及结果如表3所示。同时测定了各条件下的膜失重率，以考察改性条件对膜的结构是否产生破坏作用。

图3 CA/PEI-CBA膜的XPS谱图

表2 CA/PEI-CBA膜的表面元素组成

表3 CA/PEI-CBA膜制备正交实验安排及结果

按照文献[34]分析方法，分别对胆红素吸附量和失重率进行极差分析，结果见表4 和表5，以确定各因素的影响趋势和最佳操作水平。

表4 CA/PEI-CBA膜制备正交实验结果胆红素吸附量的极差分析

表5 CA/PEI-CBA膜制备正交实验结果失重率的极差分析

由表4中极差分析的结果可知，同一因素各水平的总和为Si，其平均效应ki为Si的平均值，ki反映了该水平的效应大小。选取同一因素反应时间各水平（1h、2h、3h、4h）的ki进行比较，其中k4最大，因此反应时间的最优水平为B4，即4h。极差R表示该因素的平均效应最大值与最小值之差，差值越大表示影响程度越大。由表4可知，其影响顺序为B＞C＞A，即影响染料改性膜的胆红素吸附量的因素依次是反应时间、染料浓度和反应温度。结果表明，最佳反应方案是A3B4C4，即反应时间4h，染料浓度5mg/mL 和反应温度60℃为最佳反应条件。

由表5中极差分析的结果可知，其影响顺序为A＞B＞C，即影响失重率的因素依次是反应温度、反应时间和染料浓度。结果表明，膜失重最大时的反应温度为80℃，如表3所示，在该温度下制备的膜失重率达到20%～30%，为了降低染料改性后的膜失重率，尽量降低反应温度。

结合表4可以看出，决定胆红素吸附量的重要影响因素为B和C，即反应时间和染料浓度，延长反应时间和增大染料浓度利于胆红素吸附量的增加。因此，优化后的染料改性膜的制备条件为反应时间4h，染料浓度5mg/mL 和反应温度30℃，在此条件下制备的膜失重率较低，为1.9%，膜失重不超过5%，均在可接受范围内。

2.3 反应温度对CBA 担载量和胆红素吸附量的影响

由正交实验和权重分析结果可知，失重率在染料改性膜的制备过程中影响较大，温度对失重的影响最大，因此，重点考察了反应温度对染料改性膜的CBA担载量和胆红素吸附量的影响，结果如图4所示。随着反应温度的升高，CBA 担载量不断增大，当温度升高至70℃，CBA 担载量由20℃的100μmol/g提高到70℃的580μmol/g。胆红素吸附量不是随着CBA 担载量单调变化，在50℃存在吸附最小值，这与预期的吸附规律不同，可能归因于膜基质在改性反应条件下发生化学基团和结构的变化。

图4 反应温度对胆红素吸附量和CBA担载量的影响

图5 水解CA和CA/PEI膜ATR-FTIR谱图

为了确定反应温度对染料改性膜基膜的影响，首先进行了CA膜和CA/PEI膜在碱性溶液中浸泡的空白实验，其ATR-FTIR 结果如图5 所示。CA/PEI膜谱图中在1744cm-1、1228cm-1和1044cm-1处具有强吸收峰，这是乙酸酯的特征谱带。水解后CA/PEI 膜在1228cm-1和1744cm-1处峰强明显降低，与同样条件下CA 膜水解结果基本一致，因此可以认为水解CA/PEI 膜在1228cm-1和1744cm-1处峰强明显降低归因于乙酸纤维素的直接水解。水解CA 膜和CA/PEI膜失重率分别为31.1%和28.5%，有研究显示，乙酸纤维素失重不超过40%都归因于其酯基的水解[35]。

其次，在反应温度20℃、40℃、60℃、80℃下制备染料改性膜CA/PEI-CBA 膜，其ATR-FTIR 谱图如图6所示。从图6中可以发现，随着温度的升高，CA/PEI-CBA 膜在1228cm-1处C—O—C 单键的伸缩振动峰和1744cm-1处C==O 键的伸缩振动峰峰强不断减弱，在60℃和80℃下制备的染料改性膜在此位置峰几乎消失，这与CA/PEI膜和CA膜的水解结果一致，因此认为染料改性过程中发生了乙酸纤维素的酯基水解。本实验在高温下（60～80℃），膜的失重率达到20%～30%，这也进一步说明失重的主要原因是酯基的水解。

图6 不同温度下制备的CA/PEI-CBA膜的ATR-FTIR谱图

为了进一步探究膜基质变化对胆红素吸附的影响，选择了20℃、40℃、80℃下制备的CA/PEICBA膜进行结构观察，SEM结果如图7所示。可以看出，随着温度升高，膜基质发生了明显的变化，膜断面结构由疏松的海绵状孔结构逐渐变得致密，孔结构通透性降低，由断面还可以明显看到，膜厚度随反应温度升高而变薄。

图7 不同改性条件下制备的CA/PEI-CBA膜的断面SEM图

这可以解释胆红素吸附的趋势变化，随着温度的升高，CBA 配基的担载量增加，染料改性膜的胆红素吸附量先增加，然后达到吸附平台区，这可能由于配基的空间位阻导致胆红素的吸附受阻。继续升高温度，染料改性膜的基质结构变得致密，配基CBA 不能有效地接触和吸附胆红素，因此，引起了染料改性膜的胆红素吸附量的迅速降低。但是随着温度的升高，更多乙酸纤维素发生水解，释放出更多羟基，因羟基也能够与CBA 发生反应，所以CBA 担载量继续升高，从而引起胆红素的吸附量继续增加。

2.4 反应时间和染料浓度对CBA担载量和胆红素吸附量的影响

本文还考察了反应时间（1～5h）和染料浓度（5mg/mL和10mg/mL）对染料改性膜的CBA担载量和胆红素吸附量的影响，具体结果如图8所示。从图8可以看出，随着反应时间的延长，CBA的担载量不断增加，当反应时间延长到4h 后，CBA 担载量达到最大值；染料浓度由5mg/mL 提高到10mg/mL，CBA担载量几乎保持不变，说明在此情况下CBA 达到饱和。当染料浓度5mg/mL、反应时间为4h 时，胆红素吸附量达到11.0mg/g 膜，继续延长反应时间，胆红素吸附量不再继续增大；当染料浓度由5mg/mL 增加至10mg/mL 后，随着反应时间由4h 延长到5h，胆红素吸附量保持不变，因此反应时间4h和染料浓度5mg/mL为最优条件。

图8 反应时间和染料浓度对胆红素吸附量和CBA担载量的影响

3 结论

本文在CA/PEI膜上接枝活性染料汽巴蓝F3GA（CBA），制备出一种染料改性亲和膜CA/PEI-CBA膜。以模拟血清溶液中胆红素吸附量为目标设计了包括反应温度、染料浓度、反应时间3个因素4水平的正交实验，极差分析可得，影响染料改性膜的胆红素吸附量的因素从大到小依次是反应时间、染料浓度和反应温度。但是影响失重率的最主要因素是反应温度，反应温度越高，失重率越大。单边实验显示，随着反应温度的升高，膜基质结构发生变化，海绵孔结构被破坏，膜变得致密不通透，不利于胆红素与配基CBA 的接触，从而影响胆红素的吸附；在较低反应温度下，延长反应时间和增大染料浓度利于胆红素的吸附，但是当反应时间超过4h、染料浓度超过5mg/mL 时，染料改性膜的胆红素吸附量几乎不增加。因此最终的实验条件确认为反应时间4h、CBA浓度5mg/mL、反应温度30℃。