连翘三萜类化合物对肝癌细胞增殖、凋亡及放疗敏感性的影响

张红

(武汉市中西医结合医院药学部，湖北 武汉 430022)

肝癌是我国发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，其发病因素较多〔1，2〕。治疗手段仍以手术为主，同时结合放化疗综合治疗，但手术有不完全、易复发的隐患，放化疗会使细胞产生对其不敏感性，难以清除癌细胞〔3〕。近些年出现的以中药为主中西医结合治疗的方式对肝癌的治疗有较好疗效〔4〕。中药有直接杀伤癌细胞、抑制肝癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡、调节和保护机体免疫、预防肝癌转移复发和病变等作用〔5〕。连翘三萜类化合物具有抗菌消炎、抗癌、抗病毒和抗氧化等作用〔6〕。研究发现连翘乙醇提取物可以抑制BGC-823细胞增殖、促进凋亡的作用〔7〕。连翘三萜类化合物桦木酸能通过诱导黑色素瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的发生〔8〕。连翘三萜类化合物安博立酸通过使细胞阻滞于S期并诱导细胞凋亡抑制人胃癌SGC-7901细胞的生长〔9〕。连翘三萜类化合物达玛-24-烯-3β-乙酰氧基-20s-醇(DM)也能抑制人胃癌细胞的生长〔10〕。本研究拟分析连翘三萜类化合物对肝癌细胞增殖、凋亡及放疗敏感性的影响及其可能的作用机制，为肝癌的预防和药物治疗提供实验依据及新靶点。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 肝癌HepG2细胞购自中国科学院上海细胞库。胎牛血清(FBS)、DMEM培养(美国Gibco)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(日本Takara)；PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)；Taq DNA Polymerase、AceQ qPCR SYBR®Green Mix(南京vazyme)；细胞板、酶标仪、流式细胞仪、硅胶层析柱(赛默飞公司)；LipofectamineTM 2000转染试剂盒(美国Invitrogen)；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)；Western印迹试剂盒(上海信裕生物技术有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙锭(PI)试剂盒(上海碧云天)；倒置显微镜(美国Olympus)；Co60医疗照射装置(中国核动力研究院)。

1.2连翘三萜类化合物DM的提取 参考孙婧等〔10〕方法，将干燥的连翘果实粉碎，于95%的乙醇中浸泡成膏，再用乙酸乙酯萃取，然后用硅胶层析柱层析，最后用石油醚和乙酸乙酯混合液分次洗脱即可。所得混合物在旋转蒸发仪中蒸干，再真空干燥箱40℃过夜，粉末状保存。以50 nmol/L的浓度溶于二甲基亚砜(DMSO)中保存，使用时按所需浓度按比例稀释。

1.3细胞培养 肝癌HepG2细胞常规培养于含10% FBS的DMEM培养基，置于37℃，含5% CO2恒温箱培养。每2～3 d传代一次。

1.4细胞转染和分组 参考孙婧等〔10〕的研究方法，取对数生长期细胞消化后，接种于96孔板(1×104个/孔)培养，DMEM培养液培养24 h后，吸去原培养液，换成不同浓度DM(0、25、50、75、100 μmol/L)的DMEM培养液，分别继续培养24、48、72 h。取常规培养的肝癌HepG2细胞消化后接种于96孔板中，待细胞生长至80%融合，更换为无血清培养基同步化12 h，随后进行转染。转染分为si-NC组(转染si-NC)、si-己糖激酶(HK)2组(转染si-HK2)、DM+pcDNA组(DM 75 μmol/L处理+转染pcDNA)、DM+pcDNA-HK2组(DM 75 μmol/L处理+转染pcDNA-HK2)，转染按照LipofectamineTM2000试剂盒进行操作。

1.5MTT法测定细胞增殖 取各组细胞培养到规定时间后，每孔加入20 μl质量浓度为5 g/L的MTT试剂，继续孵育4 h，加入150 μ DMSO，震荡混匀，在酶标仪测定各孔490 nm波长处OD值。每组设3个复孔取均值，将对照组细胞抑制率设定为0%。其余各组细胞抑制率(%)=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值×100%。

1.6qRT-PCR分析HK2 mRNA表达水平 按照Trizol说明书提取总RNA，用反转录试剂盒逆转录成cDNA，按照AceQ qPCR SYBR®Green Mix说明书进行qRT-PCR方法扩增。循环条件为95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.7Western印迹检测HK2蛋白表达 提取各组细胞蛋白，用BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。各组蛋白上样量60 μg，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，经电转将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭90 min，分别加入相应的一抗，4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次5 min；再加入相对应的二抗室温孵育2 h，PBS洗涤3次，每次10 min，暗室中显影，定影。采用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的吸光度，以目的条带和β-actin条带的比值作为蛋白表达水平。

1.8流式细胞术检测细胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化细胞，离心收集各组细胞，PBS漂洗2次，加结合缓冲液重悬细胞。依据试剂盒说明书，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式细胞仪检测激发波长488 nm和发射波长530 nm处的荧光强度。实验重复3次。

1.9细胞克隆集落形成实验 取对数生长期HepG2细胞消化后，以合适密度接种于直径为60 mm的培养皿中，细胞融合达到80%左右，分为对照组、DM组、si-NC组、si-HK2组、DM+pcDNA组、DM+pcDNA-HK2组，DM组、DM+pcDNA组、DM+pcDNA-HK2组分别加入75 μmol/L的DM，其余组不加药，加药24 h后，以上各组分别给予0、2、4、6、8 Gy的60Co医疗装置照射。照射后，按照射剂量大小分别以0.3×103、1×103、1×103、3×103、3×103的细胞密度接种于60 mm的培养皿中，继续培养10～14 d。PBS清洗2遍后甲醇固定15 min，吉姆萨染色30 min，在低倍光学显微镜下计数>50个细胞的集落。克隆形成率(PE)=克隆数/接种细胞数×100%，存活分数(SF)=照射剂量组的集落数/(该组细胞接种数×未照射组PE)。采用单击多靶模型拟合细胞存活曲线，SF=1-(1-e-D/D0)N，Dq=D0×lnN。其中D为照射剂量(Gy)，D0为平均致死剂量，Dq为准阈剂量(代表存活的宽肩度)，N为外推值。放射增敏比(SER)=单纯照射组D0/加药联合照射组D0。

1.10统计学分析 采用SPSS20.00软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1不同DM浓度对肝癌HepG2细胞增殖的影响 MTT法检测结果显示，用不同浓度DM处理肝癌HepG2细胞后，于24、48、72 h时检测细胞增殖，肝癌HepG2细胞的抑制率随着DM浓度的升高而逐渐显著升高(P<0.05)。选用作用时间48 h，抑制率为50%左右的浓度(75 μmol/L)进行后续实验。见表1。

表1 不同浓度DM对肝癌HepG2细胞抑制率的影响

2.2DM对肝癌HepG2细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示，相较于对照组〔(6.79±0.58)%〕，DM组中HepG2细胞凋亡率〔(23.49±2.14)%〕显著升高(t=13.046,P=0.000)。

2.3DM对肝癌HepG2细胞放疗敏感性的影响 细胞克隆形成实验后，通过单击多靶模型拟合计算得出，在HepG2细胞中对照组和DM组D0值分别是2.531、1.353，Dq为1.848，0.739 Gy，N为2.075、1.726，DM组SER是1.870。细胞的存活拟合曲线如图1所示，在同一剂量照射下，DM联合照射组的存活率明显小于单纯照射对照组，细胞的存活曲线明显下移；且随着照射剂量的增加，曲线下移的趋势呈现直线型。可见，DM对肝癌HepG2细胞具有辐射增敏作用。

与对照组比较：1)P<0.05图1 不同剂量照射后HepG2细胞的存活曲线

2.4DM对肝癌HepG2细胞凋亡中HK2表达的影响 Western印迹检测结果显示，与对照组相比，DM组HK2蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。 qRT-PCR检测结果显示，与对照组相比，DM组HK2 mRNA表达水平显著下降(P<0.05)。见图2，表2。

图2 HK2蛋白表达

表2 DM对肝癌HepG2细胞凋亡中HK2表达的影响

2.5抑制HK2表达对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及放疗敏感性的影响 Western印迹检测结果显示，与si-NC组相比，si-HK2组HK2蛋白表达水平显著下降(P<0.05)；MTT法和流式细胞仪检测结果显示，si-HK2组HepG2细胞抑制率和凋亡率显著高于si-NC组(P<0.05)。见表3，图3。细胞克隆形成实验后，通过单击多靶模型拟合计算得出，在HepG2细胞中si-NC组和si-HK2组D0值分别是2.596、1.452，Dq为1.888、0.775 Gy，N为2.069、1.705，si-HK2组SER是1.788。细胞的存活拟合曲线如图4显示，在同一剂量照射下，si-HK2联合照射组的存活率明显小于单纯照射si-NC组，细胞的存活曲线明显下移；且随着照射剂量的增加，曲线下移的趋势呈现直线型。

表3 抑制HK2表达对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响

图3 HK2蛋白表达

与si-NC组比较：1)P<0.05图4 不同剂量照射后HepG2细胞的存活曲线

2.6HK2过表达逆转了DM对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及放疗敏感性的作用 Western印迹检测结果显示，与对照组相比，DM组HK2蛋白的表达水平显著下降(P<0.05)；相较于DM+pcDNA组，DM+pcDNA-HK2组HK2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。MTT法检测结果显示，与对照组相比，DM组HepG2细胞抑制率显著升高(P<0.05)；相较于DM+pcDNA组，DM+pcDNA-HK2组HepG2细胞抑制率显著降低(P<0.05)。 流式细胞仪检测结果显示，与对照组相比，DM组HepG2细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；相较于DM+pcDNA组，DM+pcDNA-HK2组HepG2细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见图5，表4。

细胞克隆形成实验后，通过单击多靶模型拟合计算得出，在HepG2细胞中对照组和DM组D0值分别是2.612、1.424，Dq为1.959、0.706 Gy，N为2.117、1.642；DM+pcDNA组和DM+pcDNA-HK2组D0值分别是1.285、2.061，Dq为0.769、1.666 Gy，N为1.819，2.244，DM组SER为1.834，DM+pcDNA-HK2组为0.624。细胞的存活拟合曲线如图6显示，在同一剂量照射下，DM联合照射组的存活率明显小于单纯照射对照组，细胞的存活曲线明显下移；且随着照射剂量的增加，曲线下移的趋势呈现直线型。而在同一剂量照射下，DM+pcDNA-HK2联合照射组的存活率明显小于DM+pcDNA照射组，细胞的存活曲线明显上移；且随着照射剂量的增加，曲线上移的趋势更加明显(均P<0.05)。

图5 HK2蛋白表达

表4 HK2过表达逆转了DM对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的作用

图6 不同剂量照射后HepG2细胞的存活曲线

3 讨 论

肝癌是严重威胁人类生命健康的疾病〔11〕。中医药在肝癌的治疗中具有重要作用，中药主要通过抑制癌细胞增殖、诱导凋亡、直接杀伤癌细胞、抑制端粒酶活性、调节细胞信号转导、调节机体免疫、抑制肿瘤血管生成、逆转肿瘤耐药性等方面达到治疗肝癌的目的〔12〕。DM是从连翘中分离出的一种三萜类化合物〔13〕。研究发现 DM可调节细胞周期相关基因表达，诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡，抑制其细胞端粒酶活性，增加癌细胞的放疗敏感性〔14〕。 DM可促进胃癌BGC-823细胞凋亡，提高细胞周期中G1期的比例，还有放疗增敏作用〔15〕。谢丽等〔16〕研究也证明DM能阻滞细胞S期，诱导细胞凋亡，从而抑制细胞增殖。研究发现连翘可抑制小鼠肝癌的生长〔17〕。连翘醇提物对胃癌、肝癌、肺癌和大肠癌均有抗肿瘤效应，还能下调凋亡相关蛋白Survivin和Bcl-2 mRMA的表达〔18〕。

HK2是糖降解途径第一步反应的限速酶，研究证明在多种肿瘤中高表达，给肿瘤的生长提供重要的物质基础〔19〕。有研究表明HK2蛋白在肝癌组织中高表达，可作为预测肝癌术后肿瘤复发转移的分子标志物〔20〕。HK2在肝癌细胞中上调表达，促进肝癌细胞的迁移和侵袭〔21〕。 HK2的活化与乙肝病毒感染的肝癌发生和发展相关〔22〕。沉默HK2可抑制乳腺癌细胞增殖，促进凋亡，增加乳腺癌对放射治疗的敏感性〔23〕。HK2高表达增强放射治疗抵抗性，导致宫颈鳞癌预后不良〔24〕。HK2在卵巢癌组织〔25〕、鼻咽癌〔26〕、结直肠癌〔27〕、胃癌〔28〕中上调表达，可预测癌细胞的转移及预后。缺氧条件下，食管鳞癌中缺氧诱导因子(HIF)-1α及HK2表达升高，HIF-1α可能通过HK2影响细胞糖酵解水平〔29〕。shRNA干扰HK2基因的表达可抑制淋巴瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，提高细胞对化疗药物阿霉素(DOX)的敏感性〔30〕。

一些中药能够影响HK的活性，进而影响肿瘤的增殖。研究发现健脾化瘀解毒中药复方胃痞消能降低糖酵解酶HK2的活性〔31〕。而桑叶各有效部位可提高肝脏细胞HK的活性〔32〕。蟾蜍灵通过降低HK2的表达进而降低宫颈癌细胞的糖代谢水平，从而抑制细胞增殖〔33〕。氧化苦参碱明显降低HK的活性，通过干扰HepG2细胞能量代谢来抑制细胞增殖、促进细胞凋亡〔34〕。小豆蔻明能增强HK活性，改善胰岛素抵抗状态下细胞的糖代谢，抑制高糖高胰岛素刺激引起的血管平滑肌细胞的异常增殖〔35〕。雷公藤红素能降低胃癌细胞SGC-7901和人脐静脉内皮细胞ECV304中HK、乳酸脱氧酶(LDH)和琥珀酸脱氢酶(SDH)的活力，导致能量不足，抑制细胞增殖，从而达到抗肿瘤作用〔36〕。香加皮提取物杠柳苷能显著抑制糖酵解HK-2基因的表达而抑制急性淋巴细胞白血病的生长〔37〕。本研究发现，DM及HK2抑制表达均能下调HK2的表达，抑制肝癌细胞的增殖，促进细胞凋亡。在同一剂量照射下，DM、si-HK2联合照射组的存活率低，对增强了癌细胞的放疗敏感性。HK2过表达逆转了DM对肝癌HepG2细胞增殖抑制、凋亡促进及辐射增敏作用。