KCNE2、KCNE3基因多态性与新疆汉族老年人房颤的相关性

帕力达·阿不力孜 张雷 卡比努尔·克依木 苗海军

(新疆医科大学第一附属医院，新疆 乌鲁木齐 830000)

心房颤动(AF)是最常见的临床心律失常形式，在65岁以上的老年人中发生率高于5%，且发病呈年轻化趋势〔1〕。AF除了其本身危害外，还能引起致命的并发症，如脑血栓和脑卒中等〔2〕。AF的发病机制大致分为两种：异位冲动形成和心房折返学说，但其确切机制尚未明确〔3〕。近年来，从基因、离子通道等方面对AF发病机制研究取得了重大进展。研究表明，分布于心肌细胞上的通道基因与生命活动密切相关，其单核苷酸多态性与离子通道的重构、心房肌细胞的动作电位有极大关联性〔4,5〕。遗传连锁分析已经鉴定了染色体10q22-24，6q14-16，5p13和11p15.5上的AF基因座〔6〕。其中在11p15.5中，鉴定了遗传缺陷并发现其涉及钾离子通道蛋白基因(KCNQ)1中的杂合错义突变，KCNQ1-钾离子通道β亚基(KCNE)1和KCNQ1-KCNE2离子通道的功能增益导致缓慢性延迟整流钾电流(Iks)〔7〕。利用候选基因方法，将KCNE2中的功能获得性突变编码导入内向整流钾电流(Ik1)的离子通道，发现与两家族的家族性AF相关〔8〕。由此可见，KCNE家族基因在AF的发生和进展中有重要作用。关于AF的遗传易感性知之甚少。通过遗传学研究方法分析基因突变导致AF的机制研究有助于理解AF的分子机制和所导致的电生理改变。本研究拟探讨KCNE2 和 KCNE3 基因单核苷酸多态性与AF的相关性，以期为新的诊疗手段和方法提供思路。

1 资料与方法

1.1研究对象 纳入本研究的AF患者(AF组)均为中国汉族人，样本间无血缘关系，主要来自2013～2015年在新疆南疆和田地区墨玉县、和田县的5个乡镇，乌鲁木齐市新农大社区、和钢社区，抽取有常住户口者、年龄≥55岁者，共计251例，特发性AF 11例，器质性AF 240例。从医院体检的体格检查和心电图检查证实均无AF的个体中选取251例为对照组。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。AF的诊断标准：包括病史、体表和24 h动态心电图诊断。心电图诊断标准为：P 波消失，代之以f波，特征为振幅、形态、节律不一，频率为 350～600 次/min，心室节律(R-R间距)通常绝对不规则。 排除标准：排除家族性AF，排除合并瓣膜型心脏病、甲状腺功能亢进、心肌病、先天性心脏病、慢性肺源性心脏病、起搏器术后或心脏器质性疾病手术后等样本。研究过程中所涉及的资料收集及血样采集均获得研究对象和家人的同意，并签署知情同意书。

表1 两组一般资料比较

1.2单核苷酸多态性(SNP)位点的选择 采用标签SNP策略选择KCNE2和KCNE3 基因的SNP位点进行其与AF的相关性研究：首先在NCBI中SNP 数据库(http//：www.ncbi.nlm.nib.gov/SNP)中以KCNE2/KCNE3和homo为关键词找到人类 KCNE2 基因SNP位点为2 375个，KCNE3基因SNP位点为3 361个。在国际人类基因组单体型图计划HapMap Project 网页中(http//：www.hapmap.org)下载有关45个独立的中国汉族北京居民 KCNE2和KCNE3基因的数据，并进行SNP标签的选取。按照次等位基因频率>0.15，最小连锁不平衡相关程度(r2)值>0.8使用Haploview 软件(https：//sourceforge.net/projects/haploview/)进行标签 SNP 的筛选。最终选择了符合标准的KCNE3基因rs9516、rs10898993、rs3867279位点和KCNE2基因rs9984281位点与新疆汉族老年人进行相关性分析。

1.3实验方法

1.3.1患者外周血DNA的提取 外周血(ACD 抗凝采血管采集)DNA 的提取采用上海生工生物技术有限公司生产的磁珠法 DNA 提取试剂盒。

1.3.2实验引物设计 引物采用Peimer6.0自行设计后送上海生工生物技术有限公司合成，引物序列信息见表2。

表2 KCNE2和KCNE3 基因的SNP位点引物

1.3.3聚合酶链反应体系(PCR) PCR反应总体系为25 μl，其中DNA模板1 μl，10×Taq缓冲液(Takara) 2.5 μl，2.5 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)0.3 μl，上下游引物各1 μl，10 mmol/L氯化镁(MgCl2) 1 μl，Taq DNA聚合酶0.1 μl，去离子水11 μl。按顺序依次加入后混匀。PCR 扩增条件：预变性：95℃×4 min；变性：95℃×20 s，退火：58℃×30 s，延伸：72℃×30 s，30个循环；最后延伸：72℃×5 min；10℃保存。

1.4统计学方法 应用GraphPad Prism5.0软件进行统计学分析，对AF组和对照组基因型、等位基因频率的比较及判断是否符合Hardy-Weinberg平衡采用χ2检验；采用SHEsis在线软件(网址为http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php.) 进行连锁不平衡分析和单倍型分析；运用广义多因子降维(GMDR)软件对4个 SNPs 位点进行交互作用分析，选择最佳基因交互作用模型；采用MDR软件画出各SNP位点交互作用树状图节点图，确定其交互作用是拮抗还是协同作用，并找出高危和低危基因型组合。

2 结 果

2.1各位点Hardy-Weinberg平衡检验 rs9984281位点仅在AF组不符合Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，rs9516、rs10898993、rs3867279位点AF组和对照组均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，见表3。

表3 各位点Hardy-Weinberg平衡检验(n，n=251)

2.2各位点的基因型、等位基因频率分布及与老年AF的关联性 502例汉族人群中KCNE3基因rs9516、rs10898993位点存在(AA，AG，GG)三种基因型，基因型及等位基因频率在两组之间差异无统计学意义(P>0.05)；rs3867279位点存在(CC，CT，TT)三种基因型，基因型及等位基因频率在两组之间差异有统计学意义(P<0.05)，CT、TT基因型和T等位基因可降低老年人AF发生危险性。KCNE2基因rs9984281位点存在(AA，AG，GG)三种基因型，基因型及等位基因频率在两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各位点基因型、等位基因频率分布及与老年AF的关联性〔n(%)，n=251〕

2.3多因子降维法(MDR)分析 对KCNE3基因rs9516、rs10898993、rs3867279位点及KCNE2基因rs9984281位点进行MDR分析，基因交互作用结果见表5，四种模型中三种模型有统计学意义(P<0.05)，因为两因子模型的检验样本精确度最高0.620 1，交叉验证一致性为10/10，检验样本精确度与交叉验证一致性值越大说明模型越好，故两因子模型为最佳模型，且P=0.001 0，模型具有统计学意义，表明这两个SNP位点的交互作用与老年AF的发生可能相关联。

图1为各SNP位点交互作用的树状图，从其颜色可判断KCNE3基因rs10898993位点与KCNE2基因rs9984281位点之间存在较强的正交互作用，即协同作用，其他位点之间交互作用不明显。图2为KCNE3基因rs10898993位点与KCNE2基因rs9984281位点不同基因型组合方式对老年人AF发生的风险，图中深灰色的方格代表高危基因型组合，浅灰色的方格代表低危基因型组合，每个格子中左侧柱代表的是具有此种基因型组合的患有AF的老年人例数，右侧柱子代表的是正常老年人例数。可见rs10898993位点和rs9984281位点所组成的AA/AA、AG/AG、GG/AG和GG/GG基因型组合为高危基因型组合，AG/AA、GG/AA、AG/AA、AA/GG和AG/GG基因型组合为低危基因型组合。

表5 基因交互作用最佳模型

图1 各基因SNP位点交互作用

图2 rs10898993和rs9984281交互模型高危和低危基因型的分布

3 讨 论

AF是临床实践中最常见的心律失常，大多数AF患者患有冠心病、心脏瓣膜病、高血压或左心室功能不全〔9〕。然而，10%～30%的AF患者在没有任何已知危险因素的情况下发生AF。研究已经确定了大量家系中一系列通道基因的突变，这种结果表明AF的发展和维持存在遗传倾向〔10〕。

SNP是人类基因组上最常见的单个核苷酸的变异，对了解和认识复杂遗传性状有重要作用。通过确定基因SNP位点分型与疾病相关性，对认识疾病的遗传易感性和鉴定疾病的致病基因有重要作用〔11，12〕。如某些突变位点的基因型在特定地域和特定种族人群中表达有很大差异，或在不同种族中等位基因型和基因频率差异性显著。如李琳等〔13〕研究表明汉、维吾尔族人群血管紧张素原等位基因频率差异有统计学意(χ2=14.742，P<0.001)。另一项研究选择了构成电压门控(Kv)钾通道的调节基因：KCNE2和KCNE3基因，结果表明KCNE2和KCNE3基因的5个位点在新疆汉族和维吾尔族AF患者中基因型和等位基因分布频率比较差异均没有统计学意义〔14〕。KCNE蛋白家族KCNE1-KCNE5构成Kv钾通道的调节剂，并且其中KCNE1和KCNE3已被证明参与心律失常〔15〕。KCNE1突变可能导致Jervell和Lange-Nielsen疾病，编码minK相关肽(MiRP)1的KCNE2突变与药物诱导的心律失常，长QT综合征(功能丧失表型)和AF(功能获得表型)有关〔16，17〕。KCNE蛋白是100～200个氨基酸的多肽链。它们均包含一个细胞外N端结构域、一个假定的跨膜区段和一个细胞内C端。这些不同的结构修饰不同的K+通道的功能〔18〕。KCNE1蛋白质minK赋予IKs特征性缓慢激活。单个KCNE蛋白与K+离子通道α-亚基之间的相互作用不是特异性的。因此，minK与KCNQ1和心脏钾离子通道(HERG)相互作用，而KCNE1-3蛋白与Kv3.1和Kv3.2相互作用，导致通道门控钾通道多样化〔19〕。其他通道也与KCNE蛋白相互作用，但这种相互作用在体内的功能意义尚未阐明。研究表明，所有KCNE基因均在心脏中表达，对调节离子通道功能及心肌细胞动作电位的形成具有非常重要的作用〔20〕。不同KCNE基因之间的平衡对Kv通道具有不同影响的KCNE蛋白可以实现IKs和其他K+电流的可变调节。本研究的结果证明了AF患者中钾通道基因的重要作用，但AF患者的分子缺陷和细胞机制仍有待研究。Yang 等〔21〕收集了28个不相关中国家族AF患者资料，并对8个钾通道基因(KCNQ1，HERG，KCNE1，KCNE2，KCNE3，KCNE4，KCNE5和KCNJ2)进行了测序。在两个家族中发现KCN2的第27位(R27C)的精氨酸-半胱氨酸突变和负责背景钾电流的KCNQ1-KCNE2通道的β亚基。这两个家族中的所有受影响成员都存在突变。与KCNQ1 S140G相似，该突变对KCNQ1-KCNE2通道具有功能获得效应；与长QT综合征相关的KCNE2突变不同，它不会改变HERG-KCNE2电流。该突变也没有改变HCN通道家族的功能。因此，KCNE2 R27C是与AF的起始和(或)维持相关的功能获得突变。人KCNE3基因内的突变与早发孤立性和家族性AF有关。AF的心律失常发展可能涉及KCNE3和相关Kv通道亚基的异向心房Kv通道电流的内在心肌破坏〔22，23〕。目前AF发生和维持的机制尚未完全阐明，钾离子通道基因多态性与AF的发生和进展有相关性，这已经成为AF机制研究新的切入点。随着分子生物学手段和技术的日新月异，与AF相关的基因和位点将会被更多的发现，进一步通过位点或基因的联合分析，为不同种族和地区AF的治疗提供新思路、新靶点。