长链非编码RNA FOXD2-AS1通过靶向miR-122-5p调控肝癌细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制

谢静 郭振凯

(1新乡医学院三全学院临床学院，河南 新乡 453003；2新乡医学院第三附属医院消化内科)

肝癌是发病率与死亡率极高的恶性肿瘤，其主要特点为恶性程度高、术后易复发及转移等，同时关于肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的机制尚未完全阐明〔1〕。深入探究肝癌细胞恶性生物学行为发生机制对提高临床治疗效果及改善患者预后均具有重要意义。长链非编码RNAs(LnRNAs)在乳腺癌等多种恶性肿瘤中均异常表达，并可促进肿瘤发生及发展〔2〕。研究表明LnRNA FOXD2-AS1在多种恶性肿瘤中均呈高表达，并可促进肿瘤进展过程〔3〕。LncRNA FOXD2-AS1调节软骨细胞增殖，还可影响甲状腺癌及胶质瘤的发生和发展〔4～6〕。然而LncRNA FOXD2-AS1在肝癌中的表达和作用还未可知。通过生物信息学网站预测LncRNA FOXD2-AS1的 3′UTR存在微小RNA-122-5p(miR-122-5p)连续性结合位点，研究表明miR-122在肝癌细胞中呈低表达，上调miR-122表达可增强肝癌细胞放射敏感性，同时血清miR-122表达水平还可作为评估肝癌患者预后的重要标志物〔7，8〕。FOXD2-AS1是否通过调控miR-122-5p抑制肝癌细胞增殖和转移，还有待证明。本研究旨在通过检测肝癌细胞中FOXD2-AS1与miR-122-5p表达，通过下调肝癌SMMC-7721细胞中FOXD2-AS1表达及上调miR-122-5p表达，探究FOXD2-AS1是否通过靶向调控miR-122-5p表达影响肝癌细胞增殖、迁移及侵袭，为临床肝癌分子靶向治疗提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2、BEL-7402与正常肝细胞HL-7702均购自中国科学院上海细胞库。FoxD2-AS1 siRNA、miR-122-5p mimic、miR-122-5p抑制剂(anti-miR-122-5p)及LipofectamineTM2000转染试剂盒均购自美国Invitrogen公司；DMEM培养液、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；Mgteigel基质胶购自上海然泰生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因试剂盒购自美国Promega公司；Trizol、反转录及实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)定量试剂盒均购自美国ThermoFisher公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)试剂盒均购自上海碧云天生物科技有限公司；Transwell小室购自上海玉博生物科技有限公司；兔抗人G1/S-特异性周期蛋白(Cyclin)-D1、基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-2单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自英国Abcam公司。

1.2细胞转染及分组 用含有10%FBS的DMEM培养液培养SMMC-7721、HepG2、BEL-7402、HL-7702细胞，隔天更换培养液，当细胞汇合率达80%进行传代培养。将SMMC-7721细胞接种于6孔细胞培养板，置于温度为37℃、CO2体积分数5%的培养箱培养24 h后进行转染，根据转染试剂盒说明书分别或同时转染si-con、si-FOXD2-AS1、anti-miR-con、anti-miR-122-5p、miR-con、miR-122-5p mimic，转染6 h后更换为DMEM完全培养液，继续培养48 h后收集细胞进行后续实验。

1.3qRT-PCR检测FOXD2-AS1、miR-122-5p表达 采用Trizol法提取细胞总RNA，取适量1 μg RNA反转录为cDNA，根据SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明书配置qRT-PCR体系，反应条件为95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40次循环。采用2-ΔΔCt法计算FOXD2-AS1、miR-122-5p相对表达量。

1.4双荧光素酶报告基因检测 通过生物信息学网站预测FOXD2-AS1与miR-122-5p存在结合位点，用PCR扩增FOXD2-AS1中含有miR-122-5p结合位点片段，并将其插入荧光素酶报告基因载体，用FOXD2-AS1野生型质粒(WT-FOXD2-AS1)与突变型质粒(MUT-FOXD2-AS1)分别或同时转染SMMC-7721细胞，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测细胞相对荧光素酶活性。

1.5MTT检测细胞增殖 收集转染后各组对数生长期SMMC-7721细胞接种于96孔细胞培养板，每组均设置3个复孔，转染后24、48、72 h每孔加入20 μl MTT溶液，放入恒温培养箱内继续培养4 h，弃上清，分别加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl/孔，混匀，应用酶标仪检测各孔在波长为490 nm处的吸光度(OD)值，OD值大小表示细胞增殖活性高低。

1.6Transwell实验检测细胞迁移及侵袭 细胞迁移实验：收集各组转染后SMMC-7721细胞，胰蛋白酶消化，2 000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀并加入400 μl无血清DMEM培养液重悬细胞，调整细胞密度为1×105/ml，取细胞悬液200 μl置于Transwell小室的上室，取含10% FBS的DMEM培养液500 μl置于Transwell小室的下室，完成后放入恒温培养箱培养，7 h后除去Transwell小室的上室表面细胞，晾干后用结晶紫染色，30 min后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，置于显微镜下随机选取5个视野观察计算迁移细胞数。细胞侵袭实验：预先将50 μl Matrigel基质胶与不含FBS的DMEM培养液稀释(稀释比1∶8)，稀释后铺于Transwell小室(孔径8 μm)基底膜的上表面，其余实验步骤同细胞迁移实验，结晶紫染色30 min后用PBS洗涤，显微镜下随机选取5个视野观察并计算侵袭细胞数。

1.7Western印迹检测Cyclin-D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达 收集各组SMMC-7721细胞，预先预冷PBS洗涤，加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，蛋白上样量为20 μg/孔，电泳结束后转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭1 h，4℃下结合Cyclin-D1、MMP-2、MMP-9一抗(1∶400)过夜，室温下结合二抗(1∶1 000)2 h，TBST洗涤3次，10 min/次，ECL显色并应用凝胶成像分析系统分析各条带灰度值，计算目的蛋白条带与β-actin蛋白条带灰度值的比值。

1.8统计学处理 应用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1肝癌细胞株中FoxD2-AS1和miR-122-5p的表达 与正常肝细胞HL-7702比较，肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、BEL-7402中FoxD2-AS1水平明显升高(P<0.05)，miR-122-5p水平明显降低(P<0.05)，以SMMC-7721细胞变化最为显著，因此本研究选取SMMC-7721细胞进行后续实验。见表1

2.2FOXD2-AS1靶向调控miR-122-5p的表达 由图1可知，FOXD2-AS1基因序列上存在miR-122-5p结合位点，双荧光素酶报告实验结果显示miR-122-5p过表达可显著减弱WT-FOXD2-AS1的荧光素酶活性(P<0.05)，而结合位点突变后miR-122-5p过表达后MUT-FOXD2-AS1片段荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)，见表2。qRT-PCR实验结果显示，si-FOXD2-AS1组miR-122-5p水平(4.76±0.48)显著高于si-con组(0.99±0.10，P<0.05)；pcDNA-FOXD2-AS1组(0.32±0.03)显著低于pcDNA组(0.98±0.09，P<0.05)。

表1 肝癌细胞株中FoxD2-AS1和miR-122-5p的表达

图1 FOXD2-AS1与miR-122-5p互补的核苷酸序列

表2 双荧光素酶报告实验

2.3干扰FOXD2-AS1表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移、侵袭的影响 qRT-PCR实验结果显示，干扰FOXD2-AS1表达后SMMC-7721细胞FOXD2-AS1水平显著降低(P<0.05)，提示成功抑制FOXD2-AS1表达。MTT实验结果显示，转染后48、72 h与si-con组比较，si-FOXD2-AS1组SMMC-7721细胞增殖活性明显降低(P<0.05)。Transwell迁移及侵袭实验结果显示，si-FOXD2-AS1组SMMC-7721细胞迁移及侵袭数目均明显低于si-con组(P<0.05)，见图2、表3。

图2 检测肝癌细胞SMMC-7721迁移和侵袭(×200)

表3 下调FOXD2-AS1表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移、侵袭的影响

2.4过表达miR-122-5p对肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移、侵袭的影响 qRT-PCR实验结果显示，miR-122-5p组SMMC-7721细胞miR-122-5p表达水平明显升高(P<0.05)，提示转染成功。MTT实验结果显示，转染后48、72 h与miR-con组相比，miR-122-5p组SMMC-7721细胞OD值显著降低(P<0.05)。Transwell迁移及侵袭实验结果显示，miR-122-5p组SMMC-7721细胞迁移及侵袭数较miR-con组明显减少(P<0.05)，见表4。

2.5沉默FOXD2-AS1表达和干扰miR-122-5p表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移、侵袭的作用 qRT-PCR实验结果显示，抑制FOXD2-AS1与miR-122-5p表达后SMMC-7721细胞miR-122-5p表达水平显著降低(P<0.05)。转染后48、72 h与si-FOXD2-AS1+anti-miR-con组比较，si-FOXD2-AS1+ anti-miR-122-5p组细胞OD值明显增加(P<0.05)，细胞迁移及侵袭数均明显增多(P<0.05)，见表5。

表4 上调miR-122-5p表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移、侵袭的影响

表5 干扰miR-122-5p表达逆转沉默FOXD2-AS1表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移、侵袭的抑制作用

2.6沉默FOXD2-AS1表达和干扰miR-122-5p表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖蛋白和转移蛋白表达的影响 沉默FOXD2-AS1表达能显著抑制肝癌细胞增殖相关蛋白Cyclin-D1的表达(P<0.05)，抑制miR-122-5p表达可明显促进Cyclin-D1表达并可显著减弱沉默FOXD2-AS1表达对Cyclin-D1表达的抑制作用(P<0.05)。与si-con组比较，si-FOXD2-AS1组MMP-2与MMP-9蛋白表达显著降低(P<0.05)，与si-FOXD2-AS1+anti-miR-con组比较，si-FOXD2-AS1+ anti-miR-122-5p组MMP-2与MMP-9水平明显升高(P<0.05)，见图3、表6。

1～4:si-con组、si-FOXD2-AS1组、si-FOXD2-AS1+anti-miR-con组、si-FOXD2-AS1+anti-miR-122-5p组图3 细胞增殖蛋白和转移蛋白表达

表6 沉默FOXD2-AS1表达和干扰miR-122-5p表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖蛋白和转移蛋白表达的影响

3 讨 论

肝癌发病过程十分复杂且已严重威胁人类生命安全，研究发现LncRNAs表达异常与肝癌发生及发展密切相关〔9〕。相关研究表明LncRNA HOXD-AS1可通过调控SOX4表达进而促进肝癌细胞增殖及迁移〔10〕。由此可知LncRNA在肝癌发生及发展过程中扮演重要角色。FOXD2-AS1在膀胱癌中上调表达并可促进癌细胞增殖及迁移〔11〕。食管癌中FOXD2-AS1表达水平升高并与患者预后不良密切相关，并可能作为评估患者预后的重要指标〔12〕。结直肠癌细胞中FOXD2-AS1呈高表达并可发挥癌基因作用促进癌细胞迁移〔13〕。张清等〔14〕研究表明FOXD2-AS1在卵巢癌组织及细胞中均呈高表达，沉默FOXD2-AS1表达可通过调控miR-150-5p表达进而抑制卵巢癌细胞增殖及迁移。相关研究表明FOXD2-AS1可在胶质瘤及黑色素瘤细胞中呈高表达并可促进细胞增殖、迁移及侵袭〔15，16〕。然而，FOXD2-AS1在肝癌细胞中的研究相对较少，本研究结果提示FOXD2-AS1可能在肝癌发生及发展过程中发挥癌基因作用；另外提示FOXD2-AS1可能通过促进肝癌细胞增殖、迁移及侵袭进而促进肝癌发生及发展。

通过RNA测序数据发现miR-122-5p在肝细胞癌中呈低表达，但关于其具体作用机制尚不清楚〔17〕。Maruyama等〔18〕研究表明miR-122-5p在胃癌组织中呈低表达并可作为临床诊断的新型分子标志物。Xu等〔19〕研究表明miR-122-5p可通过靶向调节醛缩酶(ALDOA)表达进而抑制胆管癌细胞增殖、迁移及侵袭。本研究结果提示miR-122-5p可能在肝癌发生及发展过程中发挥抑癌基因作用。为了探究miR-122-5p对肝癌细胞的生物学行为的影响，本研究结果提示miR-122-5p可抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭。LncRNA可通过竞争性吸附miRNA促使其表达下调进而发挥作用〔20〕。应用生物信息学网站预测显示FOXD2-AS1可互补结合miR-122-5p，双荧光素酶报告实验结果显示FOXD2-AS1可靶向调控miR-122-5p表达。提示FOXD2-AS1可通过调控miR-122-5p表达进而影响肝癌发展过程。同时本研究进一步研究FOXD2-AS1对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响及其与miR-122-5p表达的关系，结果发现沉默FOXD2-AS1表达后再抑制miR-122-5p表达可提高肝癌细胞增殖活性并促进Cyclin-D1表达，肿瘤细胞异常增殖是导致肿瘤发生的主要原因，Cyclin-D1蛋白与细胞增殖有关，其表达水平异常升高可促进细胞增殖，下调Cyclin-D1表达可抑制细胞增殖〔21〕。本文结果提示沉默FOXD2-AS1可通过靶向调控miR-122-5p表达并下调Cyclin-D1表达进而抑制肝癌细胞增殖。肿瘤细胞迁移及侵袭是恶性肿瘤发展的主要原因〔22〕。本研究结果显示沉默FOXD2-AS1表达可显著减少肝癌细胞迁移及侵袭数目并降低MMP-2、MMP-9表达，再加入anti-miR-122-5p可明显减弱沉默FOXD2-AS1表达对肝癌细胞迁移、侵袭及其相关蛋白表达的抑制作用，MMP-2、MMP-9可通过降低细胞外基质进而促进肿瘤细胞迁移〔23〕。本文结果提示沉默FOXD2-AS1表达可通过上调miR-122-5p表达降低肝癌细胞迁移及侵袭能力。

综上，FOXD2-AS1可靶向调控肝癌细胞miR-122-5p表达，沉默FOXD2-AS1可通过诱导miR-122-5p表达减弱肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，可为肝癌靶向治疗提供新方向。