NLRP3介导线粒体损伤在非酒精性脂肪性肝炎中的作用及SS-31的干预研究*

林晔

非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的主要进展形式，具有较高的肝纤维化和肝癌风险，主要病理特征包括脂肪变性、气球样变、肝细胞损伤、混合性炎细胞浸润和不同程度的纤维化[1-2]。近期研究发现，线粒体结构和功能异常参与NASH 的起病与进展，炎症小体在炎症以及纤维化进展中起到关键作用[3-6]。本研究旨在明确NLRP3 介导线粒体损伤在NASH 中的作用机制，以及具有线粒体保护作用的线粒体靶向抗氧化肽SS-31 对NLRP3 信号通路的作用以及对NASH 的影响，以寻求干预NASH的有效药，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 选择健康8 周龄雄性C57BL/6J 小鼠共30 只，体重150～180 g，平均（171.33±10.12）g，购自中国科学院动物试验中心。SS-31（广州天源生物科技有限公司）、HE 染液（上海莼试生物技术有限公司）、Caspase-1 一抗、IL-1β 一抗、IL-18一抗、Caspase-1 二抗、IL-1β 二抗、IL-18 二抗（均购自美国Abcam 公司）、DAB 显色液（广州鼎国生物技术有限公司）、苏木素（成都格利普生物科技有限公司）、Trizol 试剂（深圳时代生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 构建NASH 模型 采用胆碱-蛋氨酸缺乏（MCD）饲料喂养法，连续喂养8 周，脱颈法处死获得肝脏组织，HE 染色病理观察肝脏出现脂肪变、炎症浸润和纤维化，符合NASH 病理改变为造模成功。

1.2.2 实验分组和观察指标 30 只小鼠按随机数字表法分为对照组、模型组和干预组，每组10 只。对照组正常饮食喂养，模型组和干预组采用MCD 饲料喂养。干预组腹腔注射SS-31 3 mg/kg，1 次/周；对照组注射等量0.9%氯化钠溶液，共持续喂养8 周。观察各组小鼠体重，使用生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）含量；HE 染色观察肝脏组织病理变化；实时定量PCR（RT-PCR）法检测肝脏线粒体损伤指标，包括ATPase-6 和细胞色素C 基因表达量；改良氧电极法测定线粒体呼吸控制率（RCR）与线粒体琥珀酸脱氢酶（SDH）活性；免疫组化染色检测肝脏NLRP3 表达量；Western blot 法检测肝脏Caspase-1、白介素（IL-1β）和IL-18 表达水平。

1.2.3 免疫组化染色 肝脏组织石蜡切片厚度4 μm，经脱蜡、水化、抗原修复后滴加兔抗鼠NLRP3 抗体（工作浓度1︰2 000）置于湿盒内4 ℃孵育过夜，以正常小鼠IgG 作为阴性对照；PBS 洗涤后滴加羊抗兔抗体（工作浓度1︰500）置于湿盒中27 ℃孵育20 min；PBS 洗涤后滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液置于湿盒中27 ℃孵育20 min；PBS 洗涤、DAB 显色、苏木素复染等操作，于光学显微镜下观察，采用半定量法，计算黄染阳性细胞百分比。

1.2.4 RT-PCR 法 Trizol试剂提取细胞中总RNA，测定浓度后根据反转录试剂盒提示合成cDNA，设计引物序列，ATPase-6：上游5’-GGTTTCATCCAGGATCGAGCAGG-3’，下 游5’-ACAAAGATGGTCACGGTCTGCC-3’；细胞色素C：上游5’-ACTACTTCTCCCGCCGCTAC-3’，下游5’-GAAATCAAACAGAGGCCGCATG-3’；内参U6：上游5’-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3’，下游：5’-GCACTGTGTTGGCGTACAGG-3’。根据反应试剂盒提示配置反应体系和设置反应参数，ATPase-6 和细胞色素C 基因表达量结果以2-⊿⊿Ct法表示。

1.2.5 Western blot 法 组织匀浆后加RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后使用β-actin 抗体进行剂量标准化；取30 μg 样品蛋白和内参蛋白，经8% SDS-PAGE 电泳分离，将分离区带电转移至PVDF 膜，滴加羊抗鼠Caspase-1、IL-1β 和IL-18抗体（1︰2 000）静置过夜，PBS 洗涤后滴加兔抗羊对应抗体（1︰500）室温孵育4 h，PBS 洗涤，ECL显色。结果行半定量分析，以样品蛋白与内参蛋白的电泳条带灰度值的比值表示。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0 软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（）表示，三组间比较采用单因素ANOVA 分析，组间比较采用独立样本t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组喂养前、喂养2、4、8 周时体重和血清AST 和ALT 含量比较 三组小鼠均成功喂养8 周，无死亡。喂养前，三组体重、血清AST 及ALT 的含量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。喂养2～8 周，对照组体重、血清AST 和ALT 含量的波动幅度不显著，差异均无统计学意义（P＞0.05）；喂养2～8 周，模型组小鼠体重逐渐减小，血清AST 和ALT 含量均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。喂养2、4、8 周，干预组均体重高于模型组，而血清AST 和ALT 含量均低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1 和图1。

表1 三组喂养前、喂养2、4、8周时体重和血清AST和ALT含量比较（）

表1 三组喂养前、喂养2、4、8周时体重和血清AST和ALT含量比较（）

表1 （续）

表1 （续）

图1 三组喂养2、4、8周时体重、血清AST和ALT含量的比较

2.2 HE 染色观察喂养8 周三组肝脏组织变化对照组肝脏无脂肪变，模型组出现不同程度的脂肪变、炎症浸润和纤维化，符合NASH 病理改变，造模成功；干预组上述变化较模型组减少，见图2。

2.3 三组ATPase-6 和细胞色素C 基因表达情况比较 模型组ATPase-6 和细胞色素C 基因表达量均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。干预组ATPase-6 和细胞色素C 基因表达量均低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2与图3。

表2 三组ATPase-6 和细胞色素C基因表达（）

表2 三组ATPase-6 和细胞色素C基因表达（）

2.4 三组线粒体RCR 和SDH 活性比较 模型组线粒体RCR 高于对照组，而SDH 活性低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。干预组线粒体RCR 低于模型组，而SDH 活性高于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3 和图4。

表3 随着线粒体RCR和SDH活性比较（）

表3 随着线粒体RCR和SDH活性比较（）

图2 HE染色观察喂养8周三组肝脏组织变化（100×）

图3 RT-PCR法检测三组ATPase-6 和细胞色素C基因表达量

图4 三组肝脏线粒体RCR和SDH活性比值

2.5 三组NLRP3 表达量比较 模型组NLRP3 阳性表达量（35.61±9.40）%高于对照组（6.92±2.32）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预组NLRP3 阳性表达量（16.72±5.51）%低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5、6。

图5 免疫组化染色检测三组NLRP3阳性表达（400×，箭头指NLRP3）

图6 三组NLRP3表达量比较

2.6 三组Caspase-1、IL-1β 和IL-18 表达比较 模型组Caspase-1、IL-1β 和IL-18 表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。干预组Caspase-1、IL-1β 和IL-18 表达水平均低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4 和图7。

表4 三组Caspase-1、IL-1β和IL-18表达水平比较（）

表4 三组Caspase-1、IL-1β和IL-18表达水平比较（）

图7 Western blot法检测三组肝脏组织Caspase-1、IL-1β和IL-18表达水平

3 讨论

研究发现，非甘油脂肪酸代谢产物在脂毒性和NASH 的发生发展中起重要作用，代谢相关氧化应激、自噬、炎症被认为是NASH 进展的重要标志[7-8]。通过本研究发现，随着喂养时间延长，模型组体重逐渐减小，血清AST 和ALT 含量升高，同时间点比较，干预组体重高于模型组，而血清AST 和ALT含量低于模型组，干预组ATPase-6、细胞色素C基因表达量、线粒体RCR 与NLRP3 阳性表达量均低于模型组，而SDH 活性高于模型组（P＜0.05）；干预组Caspase-1、IL-1β 和IL-18 表达水平均低于模型组（P＜0.05）。

NAFLD 时线粒体功能降低，ATP 合成减少，ROS 消耗量减少但含量仍在增加，可能引起肝脏脂质沉积，从而加剧肝脏的氧化应激反应，导致肝细胞凋亡[9-10]。具体表现：线粒体脂肪酸氧化为机体提供能量，氧化异常导致游离脂肪酸进入肝脏含量增加，诱导氧化应激反应，损伤线粒体功能，氧化应激加剧肝细胞损伤和凋亡，氧化应激作为重要病理因素，是启动和维持NAFLD 的关键[11-13]。

炎症是NASH 发生以及纤维化进展的重要致病因素，NASH 患者体内存在促炎和抗炎细胞因子的失衡，其中NLRP3 炎性小体激活在NASH 进展中发挥重要作用。NLRP3 炎症小体活化机制主要有胞内离子浓度、线粒体功能异常和溶酶体损伤三种，NLRP3 炎症小体活化后招募并激活Caspase-1，Caspase-1 是NLRP3 炎性小体的效应蛋白，可将无活性的促炎细胞因子IL-1β 和IL-18 前体剪切为成熟的IL-1 和IL-18，从而引发机体炎症反应[14-16]。NLRP3 炎症小体信号通路可促进机体由炎症状态向纤维化进展。炎症刺激下肝星状细胞及肝细胞NLRP3 炎症小体表达明显升高[17]。肝损伤后IL-1表达增多，IL-1 受体缺陷可以缓解肝损伤及肝纤维化。提示IL-1 可能参与了从肝损伤到肝纤维化发生的整个过程[18]。Casepase-1 表达缺失可以缓解酒精性肝纤维化和非酒精性肝纤维化，提示Casepase-1同样参与肝纤维化的发生发展。临床研究表明，肝硬化患者血清IL-18 水平明显高于对照组，血清IL-18 水平与肝硬化患者Child-Pugh 评分及组织学损伤呈现正相关[19]。SS-31 是一种能够渗入细胞并且在线粒体内膜靶向定位聚集的小分子肽，SS-31在多种疾病中具有良好的抗氧化及抗凋亡作用[20]。

综上所述，NLRP3 炎性小体介导线粒体损伤参与了NASH 的发病过程，线粒体靶向抗氧化肽SS-31 可降低NASH 肝脏NLRP3 表达，改善线粒体损伤程度。