骨形态发生蛋白2浓度对兔骨髓间充质干细胞生长的影响 *

陈锐棋 黄思聪

1 广州医科大学附属第一医院输血科，广东省广州市 510120； 2 广州医科大学附属第二医院检验科

骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是组织工程较为理想的种子细胞，具有自我更新和增殖能力，能向成骨细胞、软骨细胞等分化[1]。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)可通过诱导间充质骨祖细胞分化，促进成骨细胞成熟和功能，是促进骨和软骨恢复的重要分子[2]，其中BMP-2是最有效的骨生长因子，能有效促进BMSCs向成骨细胞分化[3]。然而，BMP-2存在半衰期短、临床所需剂量大、高成本等缺点，而且大剂量使用BMP-2会诱发炎症反应，对骨组织的修复得不偿失[4]。因此BMP-2的使用浓度目前是其临床使用的一个重要讨论方向。本研究希望通过探讨BMP-2浓度对兔BMSCs(rBMSCs)生长及分化的作用并初步分析其可能的通路机制，了解BMP-2对BMSCs的生长规律的影响，旨在为临床更好地利用BMSCs提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 BMP-2(PeproTech公司)，rBMSCs(广州呼吸研究所制备与鉴定)；10%胎牛血清的MEM、0.25% 胰蛋白酶、1×磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Gibco公司。细胞计数仪(Beckman)，倒置相差显微镜(Leica)、细胞培养箱(Forma)及超净工作台(ESCO)。

1.2 rBMSCs复苏、传代、培养 从液氮冻存瓶中取出rBMSCs冻存管复苏至已含5ml 10%MEM培养液的T25中，37℃、5%CO2培养。待T25里的细胞长至85%时(约6d)，0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代至T75中培养。待T75里的细胞长至85%时(约6d)，传代至3个T75，继续培养细胞长至85%，1×PBS洗细胞后用0.25%胰蛋白酶消化细胞，10%MEM培养液将细胞浓度调为约1×104，向4×24孔板中每孔加入0.5ml细胞工作液，37℃、5%CO2继续培养。

1.3 BMP-2共培养 待步骤1.2细胞完全贴壁后(约24h)，其中3块24孔板的各孔中分别加入终浓度为100ng/ml，50ng/ml、10ng/ml的BMP-2工作液。10%MEM为对照组。每4d换液1次共12d。

1.4 细胞形态观察及细胞计数 每天用倒置相差显微镜观察步骤1.3过程中细胞的形态特征，并用0.25% 胰蛋白酶消化细胞，细胞计数仪4块24孔板中的其中两个孔进行细胞计数。以细胞培养时间为横坐标，细胞数量为纵坐标绘制兔骨髓间充质干细胞的生长曲线。

1.5 Notch通路相关分子检测 提取及检测试剂盒均购自天根公司，按操作说明检测第6天及第12天步骤1.3处理过程中各组细胞Notch1/Jagged1/Hes1(见表1)表达水平，以β-actin为内参，结果以2-△△Ct表示。

表1 Notch通路相关分子引物

1.6 统计学方法 统计结果以均数±标准差表示，采用Graphpad-Prism-6进行统计分析，生长曲线比较采用多个样本比较的秩和检验方法，细胞组间数目和基因表达比较采用ANOVA分析进行结果统计分析，P<0.05认为差异具有显著性。

2 结果

2.1 BMP-2浓度对rBMSCs细胞增殖的影响 4组rBMSCs的生长曲线(图1)显示，前6d是指数增生期，第6天细胞的增殖生长出现退化现象，从第9天开始就逐渐进入平台期。多样本秩和检验分析结果显示，100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml 3个梯度浓度的BMP-2共培养的rBMSCS生长规律与对照组无明显差别(P=0.729)。培养过程中第6、12天各组细胞量无明显差异(P=0.625)。

2.2 BMP-2浓度对rBMSCs生长形态的影响 如图2所示：第6天，对照组细胞基本保持长梭形，聚集生长现象不明显。100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml 3个浓度实验组的细胞形态逐渐由长梭形向多角形、不规则形转化，同时聚集生长现象明显加强。第12天，3个浓度实验组的细胞形态呈多样性，聚集生长明显，但组间形态无明显差异；而对照组细胞依然没有呈现出聚集生长现象。

2.3 BMP-2浓度对rBMSCs生长过程中Notch通路相关分子表达的影响 Real-time PCR结果(图3)显示，第6天，与对照组细胞相比，100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml 3个浓度实验组细胞的Notch1/Jagged1/Hes1表达均明显上升，实验组间无明显差异(P>0.05)。到第12天，实验组细胞各个基因表达均比第6天有不同程度的增加(P<0.05)，且依然高于培养同样天数的对照组细胞；对照组细胞第6天与第12天比较，Notch1/Jagged1/Hes1表达无明显改变(P>0.05)。

3 讨论

随着精准医疗的到来，各国越来越重视个体化治疗的发展和应用，随着资金的注入和研发水平的提高，细胞治疗也逐渐成为个体化治疗的主要手段。干细胞治疗手段在细胞治疗中是目前世界各国争相研究并取得重大进展的领域[1]，其中在神经系统疾病和骨缺损修复等方面的成功尤为突出[2,5]。骨缺损治疗一直是临床骨科医师所面临的难题，虽然机体本身有创面修复机制，但较大的创面缺损不能自行愈合。骨移植是治疗大骨缺损的常用方法，但自体移植存在供区骨供应有限、手术风险增加、手术时间延长等因素，异体植骨则可能会引起机体排斥反应、疾病传播、骨不连等并发症，严重限制了骨移植的临床应用[6]。干细胞治疗手段则为上述难题提供了新的治疗突破口，间充质干细胞(MSC)属于多能细胞，在早期发育中来自中胚层和外胚层[7]。首先在骨髓中发现，即骨髓间充质干细胞(BMSC)，它不仅具有胚胎干细胞的分化功能，而且可以在体外大规模复制、培养和低温保存[8]，被认为是骨组织工程的种子细胞。BMSCs可生成包括成骨细胞在内的多种细胞，并在实现和维持适当的骨量方面发挥关键作用[9-10]。

人骨形态发生蛋 白-2(BMP-2)是一种强大的骨诱导蛋白，可以招募不同组织来源的MSCs并诱导为成骨细胞[11]；2002年获得了美国FDA的批准，作为骨移植替代品用于脊柱融合和开放性胫骨骨折等[12]。BMP-2半衰期短，虽然高剂量的BMP-2可以产生良好的骨形成量，但也诱导了过度的炎症反应且导致并发症(包括：骨质量恶化、脂肪组织形成等)发生率显著增加[13]，对骨损伤的修复得不偿失。因此，高剂量BMP-2的有效性仍然是一个临床关注的重要问题[4]。本次研究使用了100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml 3个梯度浓度的BMP-2共培养rBMSCs，以无添加BMP-2的rBMSCS为对照组进行比较，发现3种浓度的BMP-2与对照组的细胞增殖生长曲线的规律基本相同，提示在文中采用的浓度范围内，BMP-2对rBMSCs的增殖促进能力并不明显，需要提升rBMSCs的增殖效率可能需要更高浓度的BMP-2。而在BMP-2加入后，细胞形态的观察发现rBMSCs分化趋势增强，同时聚集生长现象更明显，表明BMP-2对rBMSCs向功能细胞分化还是具有强大的促进作用，但结果显示BMP-2浓度对rBMSCs生长形态的影响不大。

Notch信号通路参与调节细胞生长、细胞死亡和分化程序[14]。靶细胞上的Notch受体(Notch1-4)通过配体Jagged(Jag1、Jag2) 与邻近细胞结合而被激活，Hes1则是典型Notch信号通路的下游靶基因[15]。本次实验结果显示BMP-2的加入能有效活化rBMSCs的Notch通路，该通路的相关靶基因Notch1/ Jagged1/Hes1表达均有不同程度的上升，但同样的，BMP-2浓度的改变并无引起Notch通路活化程度的差异，从Notch1/Jagged1/Hes1表达的变化可以看出，Notch通路的活化程度与rBMSCs生长分化趋势相吻合。有研究报道在成骨细胞不同分化阶段有条件地过表达Notch证实Notch通路的激活能有助BMSCs早期分化，促进骨愈合[16]。结合本次结果，我们推测BMP-2对rBMSCs生长形态的影响可能通过Notch通路实现，但并无浓度依赖性。而Inzana研究则发现Notch通路活化及加速骨形成的程度与BMSCs的减少量一致[17]，暗示Notch可能对BMSCs增殖的促进作用有限，一定程度上给结果2.1提供了合理的解释。

综上所述，BMP-2可能通过Notch通路促进rBMSCs的分化，但没有浓度依赖。提示如果保证BMSCs达到一定数量，较低浓度的BMP-2也可能达到有效促进BMSCs分化，帮助骨愈合的效果，同时有机会减低高剂量BMP-2带来过度炎症的风险。