丙泊酚抑制Wnt信号诱导的EMT降低乳腺癌细胞侵袭迁移能力的机制

吴海洋

(枣庄矿业集团枣庄医院 普外科,山东 枣庄277100)

乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤之一，我国近些年乳腺癌的发病率呈现上升趋势，其死亡率居于女性恶性肿瘤首位，严重威胁女性的生命健康[1]。目前对乳腺癌的研究主要集中于分子机制方面。丙泊酚(propofol)又称为异丙酚，是一种短效、快速的静脉麻醉药，近些年的多项研究发现，丙泊酚可影响多种肿瘤的增殖、侵袭、迁移及凋亡，如丙泊酚对人肺癌A549细胞的生长和迁移有明显的抑制作用，且可促进细胞凋亡，其机制可能与下调AQP1蛋白表达有关[2]。乳腺癌中的研究表明，丙泊酚可抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力，并诱导细胞凋亡，但机制尚未明确[3，4]。经典Wnt信号通路，也称为Wnt/β-catenin信号通路，在肿瘤发生、细胞发育等过程中被激活，进而促进肿瘤发生发展[5,6]。有研究表明，Wnt/β-catenin信号致癌的关键是β-catenin在细胞质/核内积累，β-catenin的异常表达与肿瘤发生相关，cyclinDl和c-myc是Wnt信号非常重要的靶基因[7]。研究表明，EphA2siRNA能够逆转Wnt信号激活剂LiCl诱导的胃癌AGS细胞EMT，降低发生了上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的胃癌AGS细胞的侵袭力[8]；FL118抑制乳腺癌细胞EMT的机制与Wnt通路有关[9]。本研究试图证实丙泊酚是否可通过抑制Wnt信号诱导的EMT降低乳腺癌细胞侵袭及迁移能力。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

DMEM培养基、FBS、青链霉素均购自美国Gibco；抗β-catenin、cyclinDl、c-myc、E-cadherin、vimentin和N-cadherin抗体均购自美国CST；MTT、DKK-1人重组蛋白和LiCl购自美国Sigma；Transwell小室试剂盒购自美国Corning；Matrigel基质胶购自美国BD。酶标仪购自美国Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人乳腺癌MDA-MB-231细胞购自美国ATCC。细胞在含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养液中，于5% CO2、37 ℃恒温、饱和湿度条件下常规传代培养。实验为生长至对数期的细胞。

1.2.2丙泊酚对Wnt信号及EMT相关蛋白表达的影响 收集40 μmol/L的丙泊酚处理48 h的MDA-MB-231细胞，加适量细胞裂解液于冰上反应30 min，离心，收集上清，BCA法测定上清中蛋白浓度。取适量蛋白样品，加5× SDS-PAGE上样缓冲液，于沸水中煮沸变性5 min，取变性蛋白，每孔道上样等量(30 μg)，经10% SDS-PAGE电泳分离，分离后的蛋白依次经PVDF转膜、5%脱脂奶粉封闭后，加皆为1∶500稀释的抗β-catenin、cyclinDl、c-myc、E-cadherin、vimentin和N-cadherin抗体，4 ℃摇床孵育过夜，加辣根过氧化物酶标记的 II抗，室温孵育2 h，洗涤，ECL显示，曝光，Quantityone软件测定灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH灰度值比值为各蛋白的相对表达量。

1.2.3Wnt信号抑制剂DKK-1及激活剂LiCl对MDA-MB-231细胞活力的影响 以5×103/孔的细胞浓度接种生长至对数期的MDA-MB-231细胞于96孔板，每孔100 μl，常规培养24 h后，使用100 ng/mL的DKK-1及20 mmol/L的LiCl处理MDA-MB-231细胞，细胞无特殊处理的为空白对照组，每组设置5个复孔，处理48 h后加MTT，每孔20 μl，继续培养4 h，吸去上清液，加DMSO，每孔150 μl，震荡混匀10 min，酶标仪测定490 nm处的吸光度值(A值)。

1.2.4DKK-1或LiCl对MDA-MB-231细胞EMT相关蛋白表达的影响 收集100 ng/mL的LiCl及20 mmol/L的LiCl处理48 h的MDA-MB-231细胞，参照方法1.2.2检测E-cadherin、vimentin和N-cadherin的蛋白表达。

1.2.5丙泊酚激活或抑制Wnt信号对MDA-MB-231细胞侵袭和迁移能力的影响 MDA-MB-231细胞分为对照组(细胞不经特殊处理)、丙泊酚组(40 μmol/L的丙泊酚处理细胞48 h)、丙泊酚+DKK-1组(40 μmol/L的丙泊酚及100 ng/mL的LiCl处理细胞48 h)和丙泊酚+LiCl组(40 μmol/L的丙泊酚及20 mmol/L的LiCl处理细胞48 h)。采用transwell小室检测。Transwell小室预先铺Mateigel基质胶，Transwell小室的上室中加按照上述分组处理后制备的细胞悬液(100 μl)，下室中加入500 μl含10% FBS的培养液，于5% CO2、37 ℃恒温常规孵育24 h，棉签轻拭去上室底部细胞，4%多聚甲醛及0.1%结晶紫染色后，随机计数5个高倍视野下(×200)侵袭至滤膜下表面的细胞数，取均值。检测细胞迁移能力实验的分组处理及实验方法同上，区别在于未铺Mateigel基质胶。

1.3 统计学方法

所有实验数据采用SPSS21.0软件进行分析。计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，两组数据采用独立样本t检验，多组差异比较采用单因素方差分析，两两比较采SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丙泊酚对MDA-MB-231细胞Wnt信号通路相关蛋白表达的影响

如图1所示，丙泊酚处理后的MDA-MB-231细胞Wnt信号通路相关蛋白β-catenin、cyclinDl和c-myc的蛋白表达均明显降低，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1 丙泊酚对MDA-MB-231细胞Wnt信号通路相关蛋白β-catenin、cyclinDl和c-myc蛋白表达的影响

2.2 丙泊酚对MDA-MB-231细胞EMT相关蛋白表达的影响

如图2所示，丙泊酚可上调与EMT相关的E-cadherin蛋白表达，下调vimentin和N-cadherin蛋白表达，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

图2 丙泊酚对MDA-MB-231细胞E-cadherin、vimentin和N-cadherin蛋白表达的影响

2.3 Wnt信号抑制剂DKK-1及激活剂LiCl对MDA-MB-231细胞活力的影响

如图3所示，Wnt信号抑制剂DKK-1可抑制MDA-MB-231细胞的活力，而其激活剂LiCl可增加细胞活力，与对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图3 Wnt信号抑制剂DKK-1及激活剂LiCl对MDA-MB-231细胞活力的影响

2.4 DKK-1对MDA-MB-231细胞E-cadherin、vimentin和N-cadherin蛋白表达的影响

如图4所示，DKK-1可上调E-cadherin蛋白表达，下调vimentin和N-cadherin蛋白表达，与对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.5 LiCl对MDA-MB-231细胞E-cadherin、Vim-entin和N-cadherin蛋白表达的影响

如图5所示，LiCl可下调E-cadherin蛋白的表达，上调vimentin和N-cadherin蛋白的表达，与对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.6 DKK-1或LiCl增加或降低丙泊酚对MDA-MB-231细胞侵袭和迁移能力的抑制作用

Transwell小室检测的各组细胞侵袭及迁移能力检测结果如图6所示，丙泊酚组细胞侵袭及迁移数均显著低于对照组(P<0.05)，而丙泊酚+DKK-1组细胞侵袭及迁移数显著低于丙泊酚组，丙泊酚+LiCl组细胞侵袭及迁移数显著高于丙泊酚组(P<0.05)。

图6 Transwell小室实验检测各组细胞的侵袭及迁移能力的变化

3 讨论

肿瘤侵袭及转移过程较为复杂，受多种蛋白和基因的调控，目前对多数实体肿瘤的主要治疗手段是手术切除，但难以避免术后的复发及转移[10,11]。作为肿瘤切除手术常用的静脉麻醉药，丙泊酚对肿瘤的影响受到广泛关注。有研究表明，丙泊酚可通过抑制MMP-2和MMP-9表达降低肺癌细胞的侵袭和迁移能力[12]；可通过减少Slug表达抑制卵巢癌细胞侵袭及迁移能力[13]；可通过下调microRNA-221抑制胃癌细胞增殖和侵袭能力[14]。以上研究表明，丙泊酚可通过不同途径抑制不同肿瘤细胞侵袭及迁移能力。

上皮-间质转化(EMT)是上皮细胞在特定的生理病理情况下向间质样细胞转化的现象。其生物学过程非常复杂，涉及多个步骤及多个基因，与肿瘤侵袭转移密切相关[15,16]。对大多数肿瘤来说，在其向恶性发展过程中经常伴随有细胞向上皮分化功能的丧失，进而朝间质样表型转化，而有EMT发生更易促进细胞的侵袭及迁移[17,18]，因此，EMT在恶性肿瘤侵袭和迁移中的作用已成为目前的一个研究热点。研究发现，Wnt、Notch、MAPK等多种信号转导途径参与肿瘤细胞EMT过程[19,20]。Wnt信号是细胞内一条重要的信号途径，参与细胞增殖、凋亡、分化、侵袭迁移等生物学行为的调节，在多种肿瘤中Wnt信号被异常激活，Wnt信号激活后可使β-catenin在胞质中大量聚集，进而转移至细胞核，最终激活下游cyclinDl和c-myc等的过度表达，影响细胞的生物学特性[21,22]。有研究显示，SHP2E76K和SHP2WT可通过Wnt/β-catenin信号促进结直肠癌细胞迁移和诱导EMT[23]。Raptor能通过Wnt3a/β-catenin信号通路促进EMT的发生，进而影响乳腺癌细胞的侵袭与转移[24]。

E-cadherin的丢失或减少是EMT最重要的标志，细胞中许多转录因子和生长因子如vimentin、N-cadherin、Twist1等的过表达也可诱导EMT，进而提高肿瘤的侵袭及迁移能力[25]。丙泊酚可通过抑制Wnt/β-catenin通路，下调转移瘤组织中E-cadherin和β-catenin的表达，从而抑制MADB106细胞肺转移[26]。丙泊酚可上调E-cadherin，下调vimentin、N-cadherin、p-p38等表达和降低HDACs活性，进而抑制胃癌细胞侵袭迁移及EMT过程[27]。

本研究结果显示，丙泊酚可抑制Wnt信号β-catenin、cyclinDl和c-myc的蛋白表达。上调E-cadherin表达，下调vimentin和N-cadherin表达。提示丙泊酚可抑制Wnt信号及EMT过程。Wnt信号抑制剂DKK-1及激活剂LiCl处理乳腺癌细胞后，发现DKK-1可上调E-cadherin表达，下调vimentin和N-cadherin表达，而LiCl可下调E-cadherin表达，上调调vimentin和N-cadherin表达，这提示抑制Wnt信号可抑制EMT过程，激活Wnt信号可促进EMT过程。细胞侵袭及迁移检测结果发现，丙泊酚可抑制乳腺癌细胞的侵袭及迁移能力，联合DKK-1对细胞侵袭迁移能力抑制更明显，而联合LiCl可增强细胞的侵袭及迁移能力。提示丙泊酚可通过抑制Wnt信号诱导的EMT降低乳腺癌细胞侵袭迁移能力。

综上所述，丙泊酚可抑制Wnt信号和EMT过程，抑制Wnt信号可减弱EMT，而激活Wnt信号可增加EMT，丙泊酚可通过抑制Wnt信号诱导的EMT降低乳腺癌细胞侵袭迁移能力。该研究可能为丙泊酚对乳腺癌细胞影响的机制研究提供了一定的理论依据。