CD47在膀胱尿路上皮癌组织中的表达及意义

朱亚香，王远涛，王钰雄，朱海冬，胡 钰

(1.吉林大学第一医院 泌尿外二科，吉林 长春130021；2.河南省南阳市第一人民医院 泌尿外科，河南 南阳473002；3.吉林大学中日联谊医院 病理科，吉林 长春130033)

全世界每年有近43万患者被诊断为膀胱癌，有超过16.5万患者因罹患膀胱癌而去世[1]。在我国，膀胱癌已成为发病率排名第一的泌尿系肿瘤，其发病率在2014年约为5.71/10万，死亡率约为2.35/10万，发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中分别排第13位和第12位[2]。膀胱癌的治疗方式主要包括是外科手术、化疗、免疫治疗等[3]。近年来，应用免疫检查点(immune checkpoint)抑制剂治疗膀胱癌的免疫疗法，已成为泌尿外科领域的研究热点[4,5]。

CD47，又被称为整合素相关蛋白(integrin-associating protein，IAP)，是广泛表达于细胞表面的免疫球蛋白[6]。在肿瘤免疫中，肿瘤细胞表面的CD47与巨噬细胞表面信号调节蛋白α(Signal regulatory protein α，SIRPα)结合后，激活巨噬细胞内部CD47/SIRPα抑制性信号通路，产生“别吃我(don’t eat me)”信号，即抑制巨噬细胞的吞噬活性和肿瘤相关抗原呈递作用，从而产生免疫逃逸，使肿瘤细胞逃避固有免疫系统的攻击[7]。最近的多种肿瘤动物模型研究中表明，应用CD47阻断性抗体后，可激活肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)吞噬活性，从而增强对肿瘤的抑制效应[7-10]。但目前有关CD47在膀胱癌中的表达及临床意义相关报道较少，本文旨在利用免疫组织化学方法(Immunohistochemistry,IHC)和Real-Time PCR 技术探究CD47在膀胱癌中的表达水平，并探讨其与临床特征的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取吉林大学白求恩第一医院泌尿外二科2016年6月至2018年12月经手术切除的、病例资料完整的62 例膀胱尿路上皮癌组织石蜡切片。另再选取10例膀胱尿路上皮癌组织及其癌旁正常组织的新鲜标本，各约 150 mg 左右。患者年龄44-71岁，中位年龄60岁。病理学分级：56例为高级别，6例为低级别。28例为NMIBC，34例为MIBC。13例存在淋巴结转移。16例发生术后复发。所选病例均由我院病理科依据 WHO(2004)病理分级标准确定病理分级，以国际抗癌联盟(UICC)TNM 分期标准确定临床分期。本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 免疫组化采用免疫组化MaxVisionTM法检测膀胱癌组织和正常癌旁组织CD47表达。阴性对照为使用磷酸盐缓冲液替代兔抗人 CD47 单克隆抗体(购自 abcam 生物技术有限公司)处理的膀胱癌组织，阳性对照为人卵巢癌组织。兔抗人 CD47 单克隆抗体稀释比1:100。染色步骤严格按照MaxVisionTM HRP试剂盒(鼠/兔)(购自福州迈新生物技术开发有限公司)说明书操作。

1.3 免疫组化结果判定免疫组化染色结果采用双盲法由病理科医生在显微镜下对染色后切片进行观察并进行判断。细胞膜或细胞质有棕黄色、黄色颗粒着色即为CD47阳性。通过计算每张片子4个高倍视野下细胞着色强度评分和阳性细胞数百分比级别分数的乘积来表示癌组织CD47的表达水平。根据着色强度评分为：无着色，0分；淡黄色，1分；棕黄色，2分；棕褐色，3分。细胞阳性数百分比评分：无阳性细胞，0分； <10%阳性率，1分； 10%-30%阳性率，2分；30%-70%阳性率，3分；>70%阳性率，4分。由此CD47表达水平分为0-12分。CD47表达水平<6 分表示低表达，≥6分表示高表达。

1.4 RNA提取及Real-Time PCR使用Trizol 试剂(购自invitrogen 公司)提取标本组织总RNA，实验操作严格按照Trizol 试剂说明书。使用分光光度仪(型号：Thermo scientific Nanodrop 2000C)测定各组织提取的RNA的浓度及纯度，OD260/OD280为1.9-2.1表示样品合格。按M-MLV cDNA 试剂盒(购自赛默飞世尔公司)说明将总RNA逆转录为cDNA，用于PCR扩增。逆转录反应条件为：25℃10 min，42℃60 min，95℃5min，4℃ 10 min。然后以GAPDH为内参，合成cDNA为模板，按Power SYBR○R Green试剂盒(购自美国应用生物系统公司)说明进行扩增操作和反应体系设置。引物序列为：GAPDH引物：上游引物：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′；CD47引物：上游引物：5′-GGCAATGACGAAGGAGGTTA-3′，下游引物：5′-ATCCGGTGGTATGGATGAGA-3′。Real-Time PCR反应条件为：95℃10 min，95℃10 s，60℃10 s，72℃10 s，40个循环。每个标本设置3份，取平均值。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.5 随访通过电话随访患者膀胱癌复发情况。随访截至日期为2019年3月24日，无失访患者。

2 结果

2.1 免疫组化分析CD47在膀胱癌组织中的表达

CD47阳性表达于膀胱癌细胞的细胞膜及胞质，呈黄色或棕黄色，在胞核可见少量表达。在癌巢组织中，细胞CD47表达强度明显高于周围组织(图1)。CD47在62例膀胱癌组织中，高表达率为43.5%(27/62)。

图1 CD47在膀胱癌组织中的表达

2.2 免疫组化分析膀胱癌组织中CD47的表达与临床病理特征的相关性

CD47在MIBC中的高表达率明显高于NMIBC(P=0.000)，本次所包含全部28例NMIBC均为CD47低表达(CD47表达水平<6 分)。CD47的高表达率在高级别膀胱癌中明显高于低级别膀胱癌(P<0.05)。存在淋巴结转移的患者的CD47高表达率也明显高于无淋巴结转移者(P<0.01)。在随访期内存在术后复发的患者的CD47高表达率同样高于无复发者(P<0.01)。CD47表达情况与患者年龄、性别无相关性(P>0.05，表1)。

表1 CD47的表达与膀胱癌临床病理学特征的关系

2.3 Real-Time PCR检测膀胱癌及癌旁组织CD47的表达

Real-Time PCR结果表明CD47mRNA在膀胱癌、癌旁组织的相对表达量为5.20±2.96、1.10±0.64。膀胱癌组织CD47mRNA的相对表达量明显高于癌旁组织，具有显著的统计学意义(P<0.001)，见图2。

图2 Real-Time PCR检测膀胱癌及癌旁组织CD47的表达

3 讨论

膀胱癌已成为中国乃至世界发病率最高的泌尿系统恶性肿瘤。在2018年，膀胱癌据估计在全世界约有近55万新发病例、20万死亡病例，其中男女比例均为4∶1[3，11]。吸烟和职业暴露仍然是膀胱癌最主要的危险因素[2,3]。膀胱癌的治疗因肿瘤的分期分级和患者全身状况而异，主要包括经尿道膀胱肿瘤切除术、根治性膀胱切除术、放射治疗和化疗、免疫治疗(膀胱内灌注卡介苗)等[12]。近年来，随着对免疫检查点(如PD-1/ PD-L1、CTLA-4、CD47等)认识的深入，免疫检查点抑制剂正在成为肿瘤治疗的新手段。

CD47是一种在多种肿瘤细胞膜表面过表达的免疫球蛋白，如急性淋巴细胞白血病[13]、骨肉瘤[8]、乳腺癌[14]、非小细胞肺癌、平滑肌肉瘤[15]等。肿瘤细胞表面的CD47通过与巨噬细胞表面SIRPα结合后，可激活巨噬细胞内Src家族激酶使其胞质尾端的免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIM)磷酸化，进而使酪氨酸磷酸酶SHP1/2聚集、活化；而这启动了下游分子的去磷酸化级联反应，抑制了包括吞噬活动和细胞毒性等在内的细胞活性，由此发挥CD47的“别吃我”作用，使肿瘤细胞免受巨噬细胞介导的吞噬，从而促进肿瘤细胞在体内发生免疫逃逸[16-18]。在多项动物肿瘤模型研究中表明，运用CD47阻断性抗体可通过激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性和对肿瘤抗原的提呈能力，进而激活体内抗肿瘤免疫，明显抑制肿瘤生长、远处转移，延长荷瘤动物生存时间[8,13-15,19]。还有研究表明，CD47在膀胱癌干细胞表面也呈现高表达，是膀胱癌干细胞的标记物之一，与膀胱癌干细胞的“干性”呈正相关[16,17,20]。

本研究结果表明，CD47在肿瘤组织的表达明显高于癌旁组织。CD47的高表达与膀胱癌分期分级、淋巴结转移、术后复发等存在明显相关性，提示CD47可能在膀胱癌的侵袭、转移、复发过程中扮演着重要角色。然而，本次研究也存在一定的局限性。第一,所选用病例数较少，尤其是低级别膀胱癌仅6例，使前述CD47在膀胱癌中的作用缺乏说服力；第二,未检测淋巴结中CD47的表达，特别是发生肿瘤转移的淋巴结，因为这可能会对我们认识CD47在膀胱癌中的远处转移中的作用提供新的研究方向；第三,由于随访时间较短，缺乏CD47与膀胱癌患者术后的生存时间的关系。

通过对膀胱癌中CD47/SIRPα信号通路及其它CD47信号通路的深入认识，可能使CD47逐渐发展成为具有临床应用价值的免疫检查点，为后续膀胱癌患者的个体化治疗提供新的理论支撑。