基因敲除去乙酰化酶SIRT1并靶向结合miR-138-5p诱导前列腺癌细胞PC-3氧化应激和凋亡

张志明,薛 炜*,聂志勇,桑 楠,邱建新,张 波

(1.空军军医大学第二附属医院 泌尿外科,陕西 西安710038;2.空军军医大学第二附属医院 肿瘤科,陕西 西安710038)

前列腺癌是男性中最常见的癌症，近年来其发病率和死亡率不断上升，是男性癌症相关死亡的第二大原因[1]。根据2012年GLOBOCAN的估计，2012年全世界大约有110万前列腺癌新发病例，约301.000人死亡[2]。大多数临床局限性前列腺癌患者接受根治性前列腺切除术或放疗。随后，20%至40%的患者最终出现生化复发，一旦诊断出复发，这些患者就接受雄激素剥夺治疗。虽然雄激素剥夺治疗可以延长患者的总生存期，降低患者的肿瘤负担，但最终所有患者都对雄激素剥夺治疗产生了耐药性，出现了去势性前列腺癌[3]。目前前列腺癌的分子机制尚未完全阐明，因此，研究前列腺癌的分子机制，有助于临床干预，延缓甚至抑制肿瘤的发生发展。SIRT1是沉默信息调节因子2(silent information regulator 2,Sir2)基因的哺乳动物同源基因，通过DNA修复蛋白P300、P73 NF-kB、肿瘤抑制蛋白FOXO转录因子和P53等非组蛋白去乙酰化参与多种细胞过程，包括增殖、凋亡和侵袭，在肿瘤发生中起着重要的作用[4-6]。本研究通过基因敲除去乙酰化酶SIRT1，探究其靶向结合miR-138b-5p对前列腺癌细胞PC-3氧化应激和凋亡的作用，以期为前列腺癌开发新的治疗策略提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

DMEM培养液、胎牛血清、胰酶(Invitrogen公司，美国)； MatrigelTM底膜基质(BD公司，美国)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA) 蛋白定量试剂盒(PIERCE公司，美国)；裂解缓冲液(Beyotime，Shanghai，China)；Caspase-3,Caspase-9,Bcl，Bax抗体 (NEB公司，美国)；HRP标记的山羊抗小鼠二抗(Santa Cruz公司，美国)；ELX808酶标仪(Bio-Tek公司,美国) ；凋亡检测试剂盒(BD Bioscience,San Jose,CA,USA) ；CO2培养箱(Thermo公司，美国)；Transwell小室及人工基底膜(BD公司，美国) ；电热恒温水浴箱(上海医疗器械七厂)；高速低温离心机(Beckman公司，美国)；电泳槽，电转仪(Bio-Rad公司，美国)；流式细胞仪(Becton-Dickinson,San Jose,CA,USA)；ChemiDoc XRS 凝胶/发光图像分析仪(Bio-Rad公司，美国)；凝胶成像系统GDS-800 UVP (UVP公司，美国)。

1.2 细胞培养

PC-3细胞株在补充有10%胎牛血清的DMEM培养基中生长。所有细胞均在含有5%CO2的培养箱中37℃培养。细胞汇合率达到85%以上时用0.25%胰酶进行消化传代。

1.3 实验方法

1.3.1细胞转染

将PC-3细胞传代培养于6孔板中。培养24 h后根据转染试剂盒说明书用Lipofectamine 3000(Invitrogen，Carlsbad，CA)单独或联合转染inhibitor和 shRNA-SIRT1，将细胞分为4组：对照组(Control)，miR抑制剂组(inhibitor)，SIRT1敲除组(shRNA-SIRT1)，miR抑制剂组+SIRT1敲除组(inhibitor+ shRNA-SIRT1)，48 h后对各组进行相应检测。

1.3.2RT-PCR

使用TRIzol试剂提取总RNA，并通过超微紫外光分光光度计在260和280 nm处测定吸光度。 按照试剂盒说明书，使用Super RT cDNA试剂盒合成cDNA。 此外，使用Quantifast○RSYBR○RGreenPCR Kit进行PCR，分别在95℃ 15 s 和60℃ 60 s条件下使用ABI 7500将反应激活。用于该反应的SIRT1，miR-138-5p和GAPDH的引物如下：SIRT1：5’-TGGCAAAGGAGCAGATTAGTAGG-3’,5’-CTGCCACAAGAACTAGAGGATAAGA-3’;miR-138-5p:5’-GCTTAAGGCACGCGG-3’,5’-GTGCAGGGTCCGAGG-3’;GAPDH:5’-CATCATCCCTGCCTCTACTG-3’，5’-GCCTGCTTCA-CCACCTTC-3’。

1.3.3克隆形成实验

PC-3细胞单独或联合转染shRNA-SIRT1和inhibitor 48 h后，细胞移入6孔板，每孔1000个细胞，孵育10天。在培养过程中每3天更换一次新鲜的完整培养基。细胞菌落洗涤2次，用3 ml甲醇固定15 min，加入1 ml/孔0.1%结晶紫孵育15 min,PBS洗涤3次。记录细胞克隆数，并在显微镜下观察。

1.3.4Hoechst33258细胞凋亡染色

将细胞用预冷的PBS洗涤2次，每次5 min。细胞在4℃下于 4%多聚甲醛中固定1 h。然后每孔加入1 ml Hoechst33258荧光染料，总共15 min，每次5 min，然后弃去染色液，在暗处用PBS洗涤2次，每次5 min。用荧光显微镜观察细胞并拍照(OLYMPLUSIX73，Japan) 。细胞的核浓缩和分裂被用作细胞凋亡的指标。

1.3.5试剂盒检测SOD,MDA,LDH的含量

分别采用SOD,MDA,LDH试剂盒测定PC-3细胞上清液 SOD,MDA,LDH的含量。操作步骤严格按照大鼠SOD,MDA,LDH试剂盒说明书进行。

1.3.6流式细胞术

采用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒对PC-3细胞凋亡诱导进行分析和测量。用不同浓度的二氢杨梅素或二甲基亚砜作对照，在6孔板中以每孔3×106个细胞的密度培养48 h。然后用过氧化氢处理细胞，在5% CO2、37℃的培养箱中诱导氧化应激。细胞用冷PBS冲洗3次，然后用100 μl结合缓冲液处理。然后用3 μl Annexin V-FITC(BD Bioscience) 和10 μl 碘化丙啶孵育20 min。采用流式细胞仪进行细胞凋亡。

（2）午餐或下午茶吃多了的人。比如午餐吃了自助餐，下午又没有很大的运动量，到晚餐时间一点都不饿。对于这种情况，可以考虑不吃晚餐。还有下午加餐的朋友，点心、水果、酸奶、坚果、薯片、饼干……样样都不少，吃得饱饱的，也可以考虑省去晚餐。

1.3.7免疫印迹法

使用裂解缓冲液裂解细胞样品。然后，使用BCA蛋白质测定试剂盒定量蛋白质浓度。含有20 mg蛋白质的样品在10%SDS-PAGE中分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，随后加入一抗(Caspase-3,1∶1000;Caspase-9,1∶1000;Bcl,1∶1000,Bax 1∶1000;) 于4℃封闭过夜，第二天加入对应二抗室温封闭1 h，最后滴加ECL,设置曝光参数，检测目的条带对应化学发光强弱。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 miR-138-5p和SIRT1在PC-3细胞中的表达量变化

如图1所示，miR-138-5p mimic转染PC-3细胞后，与Control组比较，miR-138-5p的表达显著升高(P<0.05)，SIRT1的表达显著降低(P<0.05)。inhibitor转染PC-3细胞后，与Control比较，miR-138-5p的表达显著降低(P<0.05)，SIRT1的表达显著升高(P<0.05)。

图1 miR-138-5p和SIRT1在前列腺癌细胞PC-3中的表达

2.2 基因敲除SIRT1抑制PC-3细胞克隆形成

如图2所示，单独或联合转染inhibitor，shRNA-SIRT1后，与Control组比较，SIRT1的表达水平显著降低(P<0.05)。与Control组比较，inhibitor组PC-3细胞克隆形成率显著升高(P<0.05)。与Control组比较，shRNA-SIRT1组PC-3细胞克隆形成率显著降低(P<0.05)。与shRNA-SIRT1组比较，inhibitor+ shRNA-SIRT1组PC-3细胞克隆形成率显著升高(P<0.05)。

图2 克隆形成实验检测细胞的生长能力

2.3 基因敲除SIRT1促进PC-3细胞凋亡

如图3所示，Control组细胞核具有弥散且较均匀的荧光。inhibitor组细胞核荧光较Control组更均匀。shRNA-SIRT1组细胞核呈不规则形状或染色质聚合分离，具有密集的颗粒荧光。inhibitor+ shRNA-SIRT1组细胞核致密染色、收缩减少，染色状态改善。与Control组比较，inhibitor组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；shRNA-SIRT1组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。与shRNA-SIRT1组比较，inhibitor+ shRNA-SIRT1组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。

图3 Hoechst33258染色检测细胞凋亡

2.4 基因敲除SIRT1对SOD，MDA，LDH含量的影响

表1 不同组SOD,MDA,LDH，GSH的含量

2.5 基因敲除SIRT1促进PC-3细胞凋亡

正常PC-3细胞经染色后发出红色荧光，提示线粒体膜电位完整。如图4所示，与Control组比较，inhibitor组线粒体膜电位显著降低 (P<0.05)，shRNA-SIRT1组线粒体膜电位显著升高(P<0.05)。与shRNA-SIRT1组比较，inhibitor+shRNA-SIRT1组线粒体膜电位显著降低(P<0.05)。

图4 不同组PC-3细胞线粒体膜电位变化

2.6 基因敲除SIRT1抑制线粒体凋亡通路相关蛋白的表达

如图5所示，与Control组比较，inhibitor组裂解的Caspase-3，Caspase-9及Bcl/Bax的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)；shRNA-SIRT1组裂解的Caspase-3，Caspase-9及Bcl/Bax的蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。与shRNA-SIRT1组比较，inhibitor+ shRNA-SIRT1组裂解的Caspase-3，Caspase-9及Bcl/Bax的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。

图5 不同组caspase-3,caspase-9,Bcl-2,Bax蛋白表达的变化

3 讨论

前列腺癌是男性最常见的癌症，是癌症相关死亡的主要原因[7]。大部分患者最终进展为化疗耐药，出现局部复发、远处转移、死亡[8]。传统的化疗由于其疗效低、副作用大，在正常组织中应用效果有限。因此，急需开发一种新的治疗策略来更有效地治疗前列腺癌。

miR-138-5p与SIRT1存在靶向关系。已有研究表明SIRT1是miR-138-5p结合的直接靶点[9]。研究发现，SIRT1基因可以通过上调癌基因和上皮-间质-间充质转化促进肿瘤生长，在前列腺癌中，SIRT1基因的表达水平升高[10]。同样，Kuzmichev等人通过免疫组织化学分析证明，SIRT1在人前列腺癌小鼠模型的癌组织中过表达，而在正常组织中的表达非常低[11]。SIRT1可通过调控多种miRNA的表达影响癌症的发展，但尚未有研究报道SIRT1是否能通过靶向调控miR-138-5p的表达影响前列腺癌细胞氧化应激和凋亡。本研究发现miR-138-5p与SIRT1在前列腺癌细胞中的表达呈负调控，用miR-138-5p inhibitor抑制miR-138-5p表达后，SIRT1的表达显著升高。因此，可进一步研究基因敲除SIRT1靶向结合miR-138-5p对前列腺癌的影响。

癌细胞无限增殖是癌症发生发展的重要机制。SIRT1过表达与更高水平的前列腺瘤PC-3细胞增殖相关[6]。研究发现基因敲除SIRT1后的胰腺癌细胞增殖明显受到抑制[12]。相关研究中，基因敲除SIRT1同样能抑制人宫颈癌细胞的增殖[13]。而有关SIRT1在前列腺癌中的研究，研究证实SIRT1可以促进人类前列腺癌细胞的增殖[14]。Duan等人研究发现miR-34a通过下调SIRT1表达抑制前列腺癌细胞增殖[15]。与前人研究结果一致，本研究发现基因敲除SIRT1明显降低PC-3细胞克隆形成率，抑制前列腺癌细胞的克隆形成，表明基因敲除SIRT1可抑制PC-3细胞的增殖生长，从而抑制前列腺癌的发展。

LDH是一种可靠的细胞毒性指标，细胞的内源性抗氧化能力与SOD、 MDA有关。研究报道称前列腺癌患者MDA水平升高，SOD活性降低，LDH活力升高[16,17]。SOD是另一种内源性抗氧化剂，可以中和自由基，保护细胞免受活性氧损伤[18]。 MDA是脂质过氧化途径的主要终产物，是前列腺癌患者氧化状态的标志物[19]。因此本研究通过试剂盒测定SOD、 MDA和LDH，与前人研究结果一致，结果发现基因敲除SIRT1提高PC-3细胞SOD活性，降低MDA含量及LDH活力，表明基因敲除SIRT1可能通过改变PC-3细胞的内源性抗氧化能力来诱导氧化应激。

抑制细胞生长和诱导细胞死亡是抑制肿瘤生长的两种主要手段。在凋亡信号的刺激下，线粒体跨膜电位(ΔΨm)的下降出现在凋亡的特征性细胞核改变之前，而ΔΨm的下降必然引起凋亡。研究发现MiR-204通过靶向SIRT1/p53通路增强阿霉素治疗的前列腺癌细胞线粒体凋亡[20]。SIRT1 siRNA能显著增强多西他赛诱导的裂解的caspase-3表达，并促进22RV1/DR细胞凋亡[6]。同样，Wang等人研究发现SIRT1的抑制导致Bax表达增加，激活的caspase-3激活以及Bcl-2的表达降低，从而导致缺氧/再灌注诱导的心肌细胞凋亡[9]。与前人研究结果相似，本研究发现基因敲除SIRT1使线粒体膜电位明显升高，提高裂解的Caspase-3，Caspase-9及Bcl/Bax的蛋白表达水平，表明基因敲除SIRT1能促进前列腺癌细胞的凋亡。

综上所述，通过基因敲除去乙酰化酶SIRT1，靶向结合miR-138-5p抑制前列腺癌PC-3细胞的生长，诱导PC-3细胞氧化应激和凋亡，以及促进凋亡相关蛋白的表达，表明基因敲除SIRT1可缓解前列腺癌的发生发展，为将来临床防治前列腺癌提供实验依据。