结直肠肿瘤组织中HIST1H3B的表达变化及意义

李凯迪,王 海,孙伯尧，刘金华,周学颖,岳新颜

(吉林大学中日联谊医院 1.检验科；2.胃肠外科；3.护理部，吉林 长春130033；4.长春中医药大学附属医院 检验科,吉林 长春130021)

结直肠癌为世界最常见的恶性肿瘤之一。内镜、粪便检查、肿瘤标志物等都是有效的结直肠癌筛查手段[1，2]。本次实验通过探究HIST1H3B在结直肠癌的表达量及临床意义，为结直肠癌诊断探究潜在的新型生物标志物。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本实验所选取的样本来源于吉林大学中日联谊医院2017年5月至2018年1月经消化外科手术所得共计34例，其采集标本的标准为：经病理科检验证实为结直肠癌Dukes B期的腺癌，且术前未经任何治疗，排除已发生远端转移的新鲜结直肠癌组织标本。同时在距离癌组织10 cm且位于癌组织上段处采集癌旁标本。将依据上述标准所获得的标本使用生理盐水彻底冲洗后，将其进行液氮速冻，后于-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1总蛋白的提取与测定

将经充分研磨后的癌组织和癌旁组织加入提前配制好的裂解液缓冲液[50 mM Tris，1% NP-40，150 mM NaCl，0.1%SDS，PMSF，0.5 mg/ml Leupeptin (亮抑制肽)]置于冰上震荡混匀。加入适量的DNA酶和RNA酶去除游离的DNA和RNA后离心。离心机设定为12 000 rpm，4℃，离心时间为15 min。离心后所得上清液即为总蛋白。按照BCA蛋白定量试剂盒说明书要求，测定其在562 nm处的吸光度，将获取吸光度绘制蛋白浓度标准曲线。

1.2.2蛋白水解多肽混合物的制备

将制备的各组蛋白样本用5倍体积的50 mmol/LNH4HCO3溶解稀释。加入适量体积1 mol/L DTT至其终浓度为20 mmol/L，56℃，避光，充分反应1 h，冷却至室温后加入1 mol/L的IAM，将其浓度调定至50 mmol/L，室温，避光反应0.5 h。在该反应体系中将蛋白∶胰酶以50∶1的比例加入，置于37℃水浴箱中12 h，产物置于-80℃的冰箱中储存。

1.2.3二维色谱质谱联用技术分析

使用0.1% FA溶解所得的蛋白多肽样品，各组样品取50 μg用于色谱上样，使用LTQXL离子肼质谱仪分析反向色谱洗脱的蛋白多肽样品，获得LC/MS质谱图。

1.2.4免疫印迹试验

使用免疫印迹试验检测目标蛋白HIST1H3B在结直肠癌组织和癌旁组织的表达量，用于验证二维色谱与质谱的分析结果。

1.2.5仪器与试剂

NH4HCO3、碘代乙酰胺、DTT、DNA酶、RNA酶、BCA蛋白质检测试剂盒、PMSF、HIST1H3B单克隆抗体、β-actin。Agilent 1200高效液相色谱仪、伯乐垂直电泳仪、LTQXL离子肼质谱仪。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 二维色谱与质谱联用技术分析结果

本次试验以图谱数差异衡量癌组织和癌旁组织中同一的蛋白的丰度。判断标准如下：一对样品中蛋白谱图数比值≥1且同时满足该对中蛋白谱图数差值≥72者定为差异蛋白。按上述标准，我们检测到28个差异表达的蛋白，其中包括18个上调表达蛋白，10个下调表达蛋白，见表1，目标蛋白HIST1H3B为上调蛋白，HIST1H3B质谱图结果见图1。

图1 结直肠癌组织及癌旁组织差异蛋白

表1 差异蛋白名称

2.2 免疫印迹试验结果

对鉴定出HIST1H3B进行免疫印迹试验，结果见图2。HIST1H3B在癌组织中表达量明显高于其配对的癌旁组织，进一步验证了LC-MS技术分析结果。

图2 免疫印迹结果

3 讨论

近年来，结肠癌在世界范围内的发病率虽有所下降，但目前结直肠癌在年轻人中的发病率呈现逐年增加的趋势。到2030年，有文献预测，年龄在20至34岁之间的人罹患结肠癌和直肠癌的的发病率均增加90%以上。这些年轻成人结直肠癌中约有35%与遗传有关[3,4]。

HIST1H3B(H3.1)是组蛋白H3家族中的成员之一，它参与构成核小体，对于维持染色体正常结构及功能方面有着重要作用，其蛋白家族簇主要由5种蛋白家族H1、H2A、H2B、H3、H4构成[5]。Xie等人通过使用逆转录定量PCR证实了组蛋白簇基因家族在乳腺癌患者中高表达。 并且从TCGA数据库中收集的临床数据分析表明组蛋白基因集的较高表达与乳腺癌患者的整体生存率，无复发生存率和远处无转移生存率有关，最终证明组蛋白基因组可以用作预测乳腺癌患者生存的预后因素[6]。有报道表明HIST1H3B在集合管癌(CDC)中上调表达[7]。Marcussen等人对8名扁桃体鳞状细胞癌(TSCC)患者在接受放射治疗前后进行了连续的口腔活检和血细胞检查并对基因表达分析。发现放射治疗后HIST1H3B表达下调[8]。Ohshima等人通过采用全外显子组测序(WES)和基因表达谱(GEP)在内的多组学分析。鉴定出HIST1H3B为肺鳞癌的依赖性扩增的驱动基因。由于基因扩增是肿瘤发生中的主要事件，鉴定驱动基因有助于理解癌症的病因，发展个体化疗法。筛选出的驱动基因可成为治疗靶标[9]。为肺鳞癌患者的治疗提供了新的备选方案。Stenman等人通过对嗜铬细胞瘤(PCC)和腹部副神经节瘤(PGL)的研究发现HIST1H3B的表达量与嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PPGL)的转移和无复发生存期均相关[10]。小儿弥漫性中线神经胶质瘤(DIPG)是脑干恶性肿瘤其患者中位生存期<1年。其患者80%会发生H3组蛋白的基因突变[11]，国际和欧洲儿科肿瘤学会DIPG注册中心合作比较了短期幸存者(STS)和长期幸存者(LTS)的临床组织分子特征发现：LTS更有可能携带HIST1H3B突变(优势比为1.28； 95%CI为1.1至1.5；P=0.002)[12]。还有研究表明发生H3-K27M突变的患者中发生H3.1(HIST1H3B/C)突变的患者的的复发率明显低于发生H3.3(H3F3A)K27M突变患者。且发生H3-K27M突变的患者对放疗不敏感[13]。H3.1-K27M 突变的肿瘤表现出间充质/星形胶质细胞表型以及缺氧抑或促血管生成的特征，为小儿弥漫性桥脑神经胶质瘤(DIPG)的患者提供新的治疗方向。

目前对HIST1H3B的研究多聚焦于甲基化、磷酸化等多钟共价修饰方面[14]，对组蛋白本身在癌症中的作用的研究较少，组蛋白在癌症发生发展中所起到的作用还尚未明确。本研究虽采用二维色谱与质谱联用技术证明了HIST1H3B在结直肠癌中的表达量上调，但HIST1H3B在结直肠癌中的的分子作用机制还值得科研工作者进一步挖掘。