血栓前状态相关基因检测在预测不良妊娠中的价值

沈 晔, 钱芳波, 尹婷婷

(江苏省无锡市妇幼保健院 计划生育科, 江苏 无锡, 214000)

目前，导致复发性流产(RSA)的因素很多，主要包括遗传因素、免疫功能异常、血栓前状态等[1-3]。以妊娠12周为分界线, ≤12周的流产多由遗传、免疫及血栓等因素引起; >12～28周的流产则多因血栓、感染等因素引起。值得注意的是，血栓是导致流产的重要因素。血栓前状态(PTS)是指血液系统持续处于高凝状态而导致机体处于易栓状态。研究[4]报道妊娠合并静脉血栓栓塞症(VTE)的发病率约为0.1%。当血栓发生于子宫胎盘循环过程中时，可能形成子宫胎盘血管的微血栓，引起不良妊娠结局，如RSA、妊娠期高血压疾病、胎盘早剥，甚至胎死宫内。安宏亮等[5]发现PTS与不明原因复发性自然流产具有相关性。本研究收集本院154例早期胚胎停育患者的临床资料，采用基因检测的方法评估PTS, 现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年6月—2019年5月本院计划生育门诊收治的154例有早期自然流产(妊娠12周内发生的非人为因素引起的流产)病史的患者，年龄21～43岁，平均(29.90±4.50)岁; 自然流产次数1～6次，平均1.84次; 主要表现为停经后出现阴道出血和腹痛，经B超检查确诊。排除存在生殖道畸形、合并内外科急慢性疾病者。

1.2 研究方法

采集受试者外周血并放置于含乙二胺四乙酸(EDTA)的试管中。采用德国罗氏MagNA pure LC 2.0核酸分离纯化及加样系统，对200 μL全血中基因组DNA进行纯化。采用德国罗氏公司生产的Light Cycler 2.0仪器，从100 ng DNA中对凝血因子Ⅴ(FⅤ)基因、凝血因子Ⅱ(FⅡ)基因、纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)5G/4G、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因677位点基因型、MTHFR基因1298位点基因型和甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)突变位点进行分析。对妊娠结局进行后续跟踪，分析不同基因多态性发生的频率，并进行数据统计和相关性分析。

2 结 果

检测结果显示, PTS低风险者18例，中风险者91例，高风险者45例。154例早期自然流产史患者资料见表1。作者发现FⅤ基因1691位点基因型及FⅡ基因20210位点基因型也均为GG, 而风险等级与FⅤ、FⅡ基因型无相关性，与民族、年龄也无相关性，而与胎停史有相关性。随着风险等级的升高，有胎停史患者、PAI-1基因-675位点基因型5G/5G、MTHFR基因677位点基因型TT的比率逐渐增高。见表2、3、4。以中风险和高风险患者例数计算PTS阳性率，结果为88.31%, 与自然流产及复发性流产有显著相关性(P<0.01)。

表1 154例早期自然流产史患者资料

表2 PAI-1基因-675位点基因型与风险等级的关系[n(%)]

表3 MTHFR基因677位点基因型与风险等级的关系[n(%)]

表4 MTHFR基因1298位点基因型

3 讨 论

随着基因序列检测技术的发展和应用，临床发现携带突变基因的人群往往具有较高的血栓发病率，且在妊娠时易诱发血栓。PTS可分遗传性PTS和获得性PTS, 前者多由凝血、抗凝血及纤溶有关的基因发生突变导致，如FⅤ突变、凝血酶原基因突变等; 后者主要由抗磷脂抗体综合征(APS)、获得性高半胱氨酸血症以及机体存在各种引起血液高凝状态的疾病等导致。正常妊娠期孕妇血液处于高凝状态，如果同时存在遗传性PTS等因素，可以导致胎盘微血栓、血流灌注不足，从而引发不良妊娠结局，包括自然流产、复发性流产、胎儿宫内发育迟缓、胎盘早剥及胎死宫内等。通过基因检测评估血栓形成风险，依据不同基因型及风险级别实施相应的抗凝治疗，可以有效减少不良妊娠结局的发生。

相关研究[6]显示，与RSA相关的主要PTS遗传因素包括FⅤ基因突变，蛋白C、S缺陷症，高同型半胱氨酸血症、PAI-1增多等，其中凝血因子Ⅴ Leiden(FⅤL)、凝血酶原G20210A基因(PTG)、MTHFR突变相关性更强。叶酸代谢中最重要的2个基因是MTHFR和MTRR, 他们也与PTS的发生密切相关。MTHFR是调节半胱氨酸和四氢叶酸代谢的关键酶。1994年, GOYETTE P等[7]最先将MTHFR基因克隆，发现多种基因多态性位点存在于MTHFR及MTRR基因，其中以MTHFR基因的C 677 T、A 1298 C和MTRR的A 66 G最为常见[8], 这些基因的突变与维生素B12、叶酸及同型半胱氨酸水平关系密切[9]。研究[10]发现MTHFR第677位核苷酸发生C→T突变，表现为MTHFR丙氨酸被缬氨酸取代，导致其活性和耐热性下降，引起高同型半胱氨酸血症，进而引起胎盘动脉栓塞和胚胎供血不足，从而引发绒毛坏死，而这一过程是发生自然流产的重要原因。

PAI-1活性升高可引发低纤维蛋白溶解，导致血液处于高凝状态，是发生PTS的重要诱因。PAI-1基因型有3种，即4G/4G、5G/5G、4G/5G型。研究[11]表明, RSA患者PAI-1基因中携带4G等位基因和4G/4G基因型时，发生自然流产的风险分别增加2.0倍和4.8倍，提示RSA与PAI-1 4G/5G基因型的多态性相关。FⅤ有GG、GA、AA共3 种基因型，具有抗凝、促凝的双重作用[12], FⅤ突变可减弱人体抗凝系统功能，其中发生1个基因突变(GA)时伴发血液高凝的概率是正常人的5～10倍，而发生2个基因突变(AA)时伴发血液高凝的概率是正常人的80倍。在凝血过程中, FⅡ突变(杂合子)会导致血液中FⅡ含量升高，进而被凝血因子Ⅴa转变为凝血酶，导致血栓形成[13]。FⅡ基因突变增高了自然流产的发生概率。一项Meta分析[14]发现FⅡ变异与习惯性流产的发生有相关性，发生FⅡ突变的患者伴发血液高凝的概率是正常人的2～3倍，因此FⅡ可作为预测早期习惯性流产的关键因素之一。研究[15]证实, MTHFR、MTRR、FⅤ、FⅡ和 PAI-1基因多态性都会促进血栓形成，进而诱发习惯性流产。

本研究还发现，同时携带2种血栓易感基因型患者较携带1种血栓易感基因型患者更容易发生RSA, 这表明同时携带PAI-1 4G/4G基因型和MTHFR TT基因型可增高自然流产的发生概率。因此, RSA患者若检测出携带4G/4G基因型和/或MTHFR TT基因型，应在孕前和孕期进行抗凝治疗，并适量补充叶酸和维生素B12, 以预防流产的发生。