一株耐铁细菌的筛选与培养及其重金属耐受性研究

火艳丽，薛林贵，常思静，马梅兰，陈娟博

(兰州交通大学 化学与生物工程学院，兰州 730070)

铁矿石的开采、加工和冶炼过程都会带来大量的尾矿堆积，产生一系列的环境问题[1].铁尾矿中的Fe、Mn、Zn、Cu、Pb、Cd等重金属元素，易污染土壤，危害人体健康和植物生长[2].铁过量，对于人体来说，过量的铁会储存于肝脏，使肝脏受到损伤，继而引发肝细胞瘤和肝纤维化等疾病，有研究学者发现铁的过量与肝脏、肺、食道、肠道等多器官的肿瘤相关[3]，对于植物体，过多的铁会引起铁中毒，使植物的生长受到抑制[4].

生物修复是重金属污染土壤的修复方法之一，通过植物、动物、微生物及其他生物的生命活动，实现土壤中有害物质的降解、转化、吸收[5].这种方法是公认的生态友好型修复方法，成本相对较低，不易造成二次污染.

微生物对重金属的耐受机理较为复杂，从国内外研究学者的报告中可以看出，主要是通过其菌体表面的氧化还原作用、吸附与络合效应、胞外沉淀作用、静电结合作用、离子交换型吸附作用、胞内累积效应等方式实现[6-7].微生物在重金属离子胁迫的条件下，耐受力较弱的微生物可能会快速减少或者死亡，耐受力较强的微生物能够正常存活[8]，因而有许多研究学者筛选和驯化可以耐受重金属离子的微生物，已获得了Cd耐性菌株[9-10]、Pb耐性菌株[11-12]、Zn耐性菌株[12-13]、Mn耐性菌株[14]以及Cu耐性菌株[9,15]，魏波等[16]通过实验发现1450果酒酵母能够耐受1.52 mol/L的FeSO4；张晓东[17]筛选到1株耐铁(FeSO4)500 mg/L蜡状芽孢杆菌(Bacillustoyonensis)；魏超等[18]通过高Fe选择性培养基，分离出1株耐铁的希瓦氏菌(Shewanellasp.)，该菌可在50 mg/mL FeSO4液体培养基中生长.这些菌株能够耐受较高浓度的重金属离子，为微生物法修复重金属污染环境提供了研究材料.但土壤调查显示，重金属污染的土壤中通常存在着多种重金属离子，而非某一种重金属离子造成的单一污染[19].因此，仅用一种重金属元素筛选出来的某一种重金属离子的耐受菌株，可能会出现不能耐受其他重金属离子的现象，从而导致生物修复实践中的修复效果受限.目前针对单一菌株对多种重金属离子共同修复的报道相对较少.

本文采集张掖市临泽县平川镇铁尾矿矿区的土壤，拟筛选出能够耐受高浓度Fe3+的细菌，优化其培养条件，并研究该菌株对多种重金属离子的耐受性，以期合理开发自然界中铁尾矿修复的微生物资源，为尾矿污染环境的生态修复提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 供试样品

供试土壤样品采自张掖市临泽县平川镇铁尾矿矿区(N 39°30′，E 100°15′)表层5～10 cm 的土壤，样品采集后放于无菌密封袋中，带回实验室，过筛，分装，取部分土壤进行试验，其余土壤样品分别置于4 ℃和-80 ℃冰箱贮存.

1.1.2 实验试剂

所用生化试剂均购于甘肃金博研生物科技有限公司，重金属离子母液配制方法为：准确称取一定质量的固体重金属离子盐溶解后定容，过滤除菌后贮存待用.

1.1.3 培养基

LB培养基：酵母浸出粉0.5%；氯化钠1%；蛋白胨1%；pH值7.0～7.2；固体培养基加琼脂1.5%～2%.

LB’培养基：酵母浸出粉0.5%；氯化钠0.5%；蛋白胨1%；pH值7.0～7.2；固体培养基加琼脂1.5%～2%.

选择培养基：LB培养基添加相应浓度的金属离子溶液.

1.2 方法

1.2.1 菌株的筛选

取过筛的铁尾矿土样5 g，加入45 mL浓度为0.9%的无菌生理盐水中，置于摇床振荡1 h，静置后取5 mL上清液，转接到Fe3+(化合物FeCl3·6H2O)浓度50 mg/L的45 mL培养基中，在温度为30 ℃下振荡培养48 h；取0.1 mL菌液梯度稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌悬液，取10-4、10-5、10-6浓度的菌悬液0.2 mL分别涂布Fe3+浓度50 mg/L的固体培养基，置于30 ℃培养箱中培养，观察细菌的生长状况；若生长状况良好，则取5 mL Fe3+浓度50 mg/L的菌液转接到含Fe3+浓度100 mg/L的45 mL新鲜培养基中，培养48 h.

按照上述步骤，参考凌薇薇[14]的方法，将培养后的菌液依次转接到Fe3+浓度200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L的45 mL新鲜培养基中，培养48 h.取0.1 mL菌液(Fe3+浓度1 000 mg/L)，用无菌水梯度稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌悬液，取10-4、10-5、10-6浓度的菌悬液0.2 mL分别涂布Fe3+浓度1 000 mg/L的平板，重复涂布3个平板作为平行实验，30 ℃静置培养48 h.挑选培养基上长势情况较好、菌落形态有差异的单菌落，用平板划线法进行分离纯化，反复划线培养，直到获得单克隆菌落，将获得的菌株编号，并用甘油冻存法置于-80 ℃冰箱冻存.

1.2.2 菌株的鉴定

形态学鉴定：菌株在LB固体培养基上划线，直到长出单菌落后，记录菌落的颜色、形状、大小、透明度、是否隆起、边缘特征及光滑度等生物学性状.通过单染色观察菌株在显微镜下的形态及细胞大小；通过革兰氏染色反应观察染色反应的特性.

分子生物学鉴定：用PCR(聚合酶链式反应，polymerase chain reaction)的方法，以菌株总DNA为模板，16s rRNA分子序列为目标序列，对菌种进行鉴定.

在PCR反应体系中加入DNA模板1.0 L，上游引物27F 1.0 L，下游引物1492R 1.0 L，Premix Taq 12.5 L，加双蒸水至总量25.0 L，混匀后置于PCR仪中进行扩增反应.反应程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃总延伸10 min.

PCR产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后，PCR产物送擎科公司进行测序；得到的16s rRNA序列，通过NCBI数据库中的Nucleotide Blast程序进行序列相似性比对，确定菌株的物种分类，并用MEGA 5.0软件构建系统发育树，分析菌株与相似物种的亲缘关系.

1.2.3 培养条件对菌株生长的影响

以pH 7.0、2%接种量、150 r/min、1% NaCl、30 ℃为基准条件，研究不同接种量、不同温度、不同pH值、不同渗透压和不同通气量对菌株生长的影响.

接种量：按照接种量1%、2%、3%、4%、5%(每个接种量3个重复)，其他条件均为基准条件，摇床培养24 h取样，用紫外分光光度仪测定菌体OD600的数值.

温度：按照温度梯度20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃(每个温度3个重复)，其他条件均为基准条件，分别置于相应温度的摇床培养24 h取样，测菌体OD600.

pH值：按照pH值5，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8(每个pH值3个重复)，其他条件均为基准条件，摇床培养24 h取样，用紫外分光光度仪测定菌体OD600的数值.

NaCl浓度的影响：菌株以2%的接种量，分别接种于pH值为7.0、NaCl终浓度分别为0%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%的液体LB培养基中(每个NaCl浓度3个重复)，其他条件均为基准条件，摇床培养24 h取样，用紫外分光光度仪测定菌体OD600的数值.

摇床转速：摇床转速依次设为100、120、150、180、200 r/min(每个转速3个重复)，其他条件均为基准条件，分别置于相应转速的摇床中培养24 h取样，用紫外分光光度仪测定菌体OD600的数值.

1.2.4 菌株对Fe3+耐受能力的测定

菌株在固体LB’培养基上划线活化，培养待长出单菌落后，挑取适量单菌落接种到液体LB’培养基中，置入摇床振荡培养14 h做为种子液，按照1%的接种量将种子液分别接种于Fe3+终浓度为50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L的液体LB’培养基中(每个浓度3个重复)，置于30 ℃的摇床中以150 r/min的转速振荡培养24 h，观察菌株生长状况并取样，以空白液体培养基为对照，用紫外分光光度仪测定菌液在600 nm处的吸光值，以OD600的数值表征培养液中的菌体浓度，评估菌株在富含Fe3+培养基中的生长状况.

1.2.5 菌株对不同重金属离子耐受能力的测定

菌种的活化和种子液的制备同1.2.4.菌株以1%的接种量，分别接种于添加有各个终浓度(如表1所列)金属离子的液体LB’培养基中(每个浓度3个重复)，各组均置于30 ℃的摇床中以150 r/min的转速振荡培养24 h，观察菌株生长状况并取样，以空白液体培养基为对照，用紫外分光光度仪测定菌液在600 nm处的吸光值，以OD600的数值表征培养液中的菌体浓度，评估菌株在不同浓度的重金属离子存在时的生长状况.

表1 各个金属离子及其添加终浓度梯度Tab.1 Each metal ion and its final concentration gradient mg/L

1.2.6 菌株对5种重金属离子共同耐受能力的测定

菌种的活化和种子液的制备同1.2.4.将菌株F1以1%的接种量接种于同时含有1 000 mg/L Fe3+、800 mg/L Pb2+、150 mg/L Cd2+、900 mg/L Cu2+和1 100 mg/L Zn2+的液体LB’培养基中，置于30 ℃的摇床中以150 r/min的转速振荡培养24 h，观察菌株生长状况并取样，以空白液体培养基为对照，用紫外分光光度仪测定菌液在600 nm处的吸光值，以OD600的数值表征培养液中的菌体浓度，评估菌株在5种重金属离子同时存在时的生长状况.

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

通过分离纯化，从张掖市临泽县平川镇铁尾矿矿区筛选到一株耐铁的细菌，编号F1.

2.2 菌株的鉴定

形态学鉴定：菌株F1在LB固体培养基中的生长情况如图1所示，菌株F1在LB固体培养基上生长良好，菌落呈圆形，乳白色，不透明，表面湿润有光泽，边缘较整齐；革兰氏染色呈阴性.

分子生物学鉴定：PCR扩增后的16S rRNA序列，电泳检测结果如图2所示，目的片段约1 500 bp，条带明亮.测序后的基因序列经过核酸序列同源性比对分析，发现菌株F1的16S rRNA序列同Enterobactercloacae4928STDY7071163的相似性达到100%，与相近种属菌株进行16S rRNA序列比对，并构建系统发育树，结果如图3，结合形态学特征和分子生物学测序结果，菌株F1鉴定为阴沟肠杆菌Enterobactercloacae.

2.3 培养条件对菌株生长的影响

2.3.1 接种量对菌株F1生长的影响

菌株F1分别以1%、2%、3%、4%、5%的接种量，接种于液体LB培养基中培养，24 h后测定培养液OD600值，结果如图4所示：菌株F1在接种量为1%时OD600值最高，菌株生长最好；接种量分别为2%、3%、4%、5%时，OD600值反而降低，所以，菌株F1最适的接种量为1%.总体而言，接种量的多少对菌体生物量的影响不大，但是相比而言，1%接种量的条件下，菌株生长的较好，分析原因，接种量过多，一方面可能因为菌体竞争利用培养基中的营养物质；另一方面可能会造成菌体生长过快，比接种量少的菌体更快到达衰亡期.

2.3.2 温度对菌株F1生长的影响

为了测定菌株F1的最适生长温度，菌株F1分别在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的温度下进行培养，24 h后测定不同的温度培养条件下的OD600值.结果见图5，从图中可以看出，菌株F1在30 ℃生长的最好，因而，菌株F1的最适生长温度为30 ℃.当温度低于30 ℃时，菌株生长情况基本良好；当温度为35 ℃时，菌株生长状况出现下降，低于20 ℃、25 ℃和30 ℃时的生长浓度；当培养温度为40 ℃时，菌株的生长受到显著抑制，培养液最终浓度仅为30℃培养条件下的48.3%.可以看出，菌株F1的生长温度范围广，在20 ℃～35 ℃的环境中能很好的生长，但不能耐受高温.

2.3.3 pH值对菌株F1生长的影响

在最适温度30 ℃条件下，测定不同的pH值下菌株的OD600值，结果如图6所示：在pH值为7的时候，菌株F1生长的最好；pH值在5到8的时候，F1也能良好生长，可见，F1能适应较宽范围的pH值.

2.3.4 NaCl对菌株F1生长的影响

从图7可以看出，当NaCl质量分数在0%～1.5%之间时，菌液的OD600值均在4以上，其中，NaCl质量分数为0.5%时，菌株F1生长的最好，并且在不添加NaCl的时候也可以较好的生长；当NaCl质量分数大于0.5%时，逐渐提高NaCl的质量分数，菌株的生长状态逐渐下降，但是仍然可以生长，说明该菌株能够耐受一定浓度的NaCl溶液，具有很好的渗透压调节能力，能在高盐的土壤环境中存活.

2.3.5 摇床转速对菌株F1生长的影响

将菌株F1接种后置于100～200 r/min转速的摇床中培养，结果如图8所示，当在转速150 r/min条件下培养24 h时，菌株F1的生物量最高；转速低于或者高于150 r/min时，生物量均相对降低，因而，F1最适的培养转速为150 r/min.

2.4 菌株F1对Fe3+的耐受能力

由图9可以看出，当Fe3+浓度为1 000 mg/L时，菌株依然生长的很好，但是当向液体LB’培养基中添加的Fe3+浓度高于1 000 mg/L时，培养基中会出现褐色的絮状沉淀，调节培养基的酸碱度也不能使沉淀消失，若有沉淀，则可能会使F1实际利用的有效Fe3+降低.

2.5 菌株F1对不同重金属离子的耐受能力

菌株F1对Pb2+的耐受能力，如图10所示，同上述对Fe3+的耐受能力测定时一样，当Pb2+浓度为800 mg/L时，菌株的OD600值为3.94，依然能较好的生长，当继续增加Pb2+的浓度时，培养基中出现不溶性沉淀，Pb2+溶解趋于饱和.

菌株F1能够在Cd2+浓度为150 mg/L的培养基中生长，当Cd2+浓度为180 mg/L和200 mg/L，菌株均不能生长，如图10所示.可见，F1能够耐受150 mg/L的Cd2+.

在含有Cu2+的培养基中培养，当Cu2+浓度低于800 mg/L时，菌株生长状况良好，随着Cu2+浓度的增加，菌株的生物量逐渐降低；如图10所示，当Cu2+浓度为900 mg/L时，菌株的生物量明显下降；当Cu2+浓度为1 000 mg/L时，菌株不能生长.所以，F1对Cu2+的耐受浓度为900 mg/L.

当Zn2+浓度为1 200mg/L时，菌株生长停滞，当Zn2+浓度在50 mg/L到1 100mg/L之间时，菌株均能生长.因而，F1能够耐受1 100 mg/L的Zn2+.

2.6 菌株F1对5种重金属离子的共同耐受能力

菌株F1在同时含有1 000 mg/L Fe3+、800 mg/L Pb2+、150 mg/L Cd2+、900 mg/L Cu2+和1 100 mg/L Zn2+的液体LB培养基中仍能够生长，培养24 h后，菌株的OD600平均值为1.23，但生长浓度低于各个重金属离子单一存在时的生长浓度.

3 结论

目前关于铅、镉、汞、铬、铜、锌、锰等重金属离子耐受性菌株报道的较多，而关于铁耐受性菌株的报道较少.本实验采集张掖市临泽县平川镇铁尾矿矿区的土壤样品，经过分离和纯化，筛选获得一株对铁具有较高耐受性的细菌F1，通过形态学特征和16S rRNA基因序列分析，鉴定其为阴沟肠杆菌Enterobactercloacae.对菌株F1的培养条件和重金属耐受性进行了初步研究，结果表明：

1) 该菌株最适培养温度为30 ℃，最适pH值为7.0，说明菌株可以在常温、中性的自然环境中很好的生长.

2) 该菌株最适接种量为1%，最适NaCl添加浓度为0.5%，最佳摇床转速为150 r/min.

3) 重金属耐受性实验显示，该菌株可单独在1 000 mg/L Fe3+、800 mg/L Pb2+、150 mg/L Cd2+、900 mg/L Cu2+、1 100 mg/L Zn2+的环境中生长，也可在上述五种浓度重金属离子同时存在的环境中生长，表明该菌株对环境具有较强的适应能力，在多个重金属离子共同污染土壤的修复中具有较好的应用潜力.