TDP-43、LC3在多发性肌炎及散发性包涵体肌炎中的表达及其作用

曾国勇 曾祥俊 叶 瑾

1.江西省赣州市人民医院神经内科，江西赣州 341000；2.江西省赣州市人民医院肾内科，江西赣州 341000

散发性包涵体肌炎（IBM）是特发性炎性肌病的一种亚型，老年人下肢近端和手指的个别屈肌无力是其典型表现。IBM 疾病的临床进展较慢，常规免疫抑制治疗通常效果差，最终可导致严重的残疾。IBM 的发病机理非常复杂，目前尚未完全了解[1-2]。临床上，IBM 必须区别于多发性肌炎（PM），后者是另一种富含T 细胞的炎性肌病，表现为弥漫性主要组织相容性复合体（MHC）-Ⅰ表达上调[3]，因为两种疾病对皮质类固醇激素治疗的反应明显不同，PM 通常效果良好，IBM 则几乎没有反应。临床常出现一部分IBM 患者被误诊为慢性PM 的情况，并接受了不必要的类固醇治疗[4]。鉴于当前诊断标准的局限性，研究者们做出了巨大的努力去发现具有更高灵敏度的IBM 免疫组织化学标志物。目前蛋白质聚集被认为在IBM 发病机制中具有核心作用，因此人们认为寻找与去除异常聚集蛋白有关的标志物可能用于鉴别IBM 和PM[5]。研究显示，镶边空泡（RVs）的形成都与自噬的损害存在一定相关性，自噬障碍导致自噬体积累积，这可能与自噬蛋白LC3、TDP-43 有关[6]。因此，本研究通过免疫组化法、Western blot 法等分析PM 组和IBM 组骨骼肌中TDP-43、LC3 阳性表达率及蛋白含量的差异性，进而探究TDP-43、LC3 在PM 及IBM 中的表达及其作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年3月～2019年9月我院收治的PM（26 例）、IBM（26 例）患者的中等受累肌肉进行活检，并避开肌电图穿刺点，同时保证动作轻柔未过度牵拉或挤压所取的肌肉组织，大小约0.5 cm×1.0 cm×0.5 cm，并快速冷冻。将PM 患者取出肌肉组织作为PM 组，将IBM 患者取出肌肉组织作为IBM 组。PM 组和IBM组患者性别、肌肉组织选取部位、年龄、病程等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审核批准，参与研究的患者均签署知情同意书。

表1 两组一般资料的比较

1.2 实验仪器与试剂

台式低速离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司，型号：TD4K）；莱卡冰冻切片机（北京海天友诚科技有限公司，型号：CM1850）；全自动免疫组化仪（上海永创医疗器械有限公司，型号：MY-2300）。

1.3 免疫组化法检测PM 组和IBM 组TDP-43、LC3的表达

将肌肉组织进行常规脱蜡及水化，加入2%甲醛溶液，固定，乙醇脱水，石蜡切片，切成长宽高为1.5 μm×1.5 μm×1.5 μm 的块状，冲洗，室温封闭，滴加一抗，37℃放置30～40 min，冲洗，滴加生物素化二抗（二抗试剂盒）37℃放置40 min，冲洗，二氨基联苯胺（DAB）显色，水洗终止反应，苏木精复染，分化，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。

1.4 Western blot 法检测PM 组 和IBM 组TDP-43、LC3 蛋白的含量

洗净烘干电泳槽及其他部件，制备12%分离胶，制作1 cm 的水层。将电泳装置放置聚胶1 h，配制灌注成层胶。90 V 电泳，溴酚蓝倒入分离胶，取出凝胶，放入聚偏二氟乙烯（PVDF）膜5～10 s。冰浴，杂交液稀释一抗，β-actin：1∶1000。清洗3 次，把PVDF 膜放入对应的二抗中常温孵育1.5 h，轻轻晃动。加入加入电化学发光（ECL）溶液和B 混合液约1 min，PVDF 膜检测采用自动化学发光成像分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间两两比较采用t 检验，计数资料采用频数表示，组间比较采用χ2检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肌肉组织中TDP-43、LC3 阳性表达量

IBM组肌肉组织中TDP-43、LC3 阳性表达高，PM组肌肉组织中TDP-43、LC3 阳性表达量低，两组比较，IBM 组肌肉组织中TDP-43、LC3 阳性表达明显高于PM 组（图1，封四）。

图1 两组肌肉组织中TDP-43、LC3 阳性表达（苏木精染色，400×）

2.2 两组肌肉组织中TDP-43、LC3 蛋白含量

Western blot 法结果显示：IBM 组肌肉组织中TDP-43、LC3 蛋白含量高于PM 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图2 两组肌肉组织中TDP-43、LC3 蛋白含量

3 讨论

IBM 与PM 由于对免疫抑制治疗的效果明显不同，且预后不同，因此病理诊断至关重要，特别是专家发现两类患者临床评估结果类似时。当然，IBM 与PM 存在明显的组织学重叠导致病理上的鉴别也很困难[7-8]。本研究定量评估了两种免疫组织化学标志物LC3、TDP-4 在区分IBM 和PM 诊断方面的价值，结果显示IBM 组肌肉组织中TDP-43、LC3 阳性表达更高，PM 组肌肉组织中TDP-43、LC3 阳性表达量更低，IBM 组肌肉组织中TDP-43、LC3 阳性表达高于PM 组（P＜0.05）。Western blot 法检测结果显示，PM 组肌肉组织内的TDP-43、LC3 蛋白含量最低，IBM 组肌肉组织内的TDP-43、LC3 蛋白含量最高，IBM 组肌肉组织中TDP-43、LC3 蛋白含量高于PM 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。IBM 发病机制的一种模型表明，细胞质蛋白的积累是逐步发生的，首先发生自噬通量受损（通过LC3 累积检测到），随后发生TDP-43 和其他错误折叠的蛋白质的聚集，进而出现IBM，病情逐步加重[9]。研究发现，TDP-43、LC3 表达水平与IBM 的形成及增长有显著相关性，在患者体内TDP-43、LC3阳性数量越多则病情越严重[10-11]。实验得出，IBM患者TDP-43、LC3 阳性表达率显著高于健康人群，得出TDP-43、LC3 可能参与了IBM 的发生及发展[12]。研究显示，在PM 患者体内，TDP-43、LC3 表达水平均比健康人体高[13]。研究人员建议采用免疫组化法区分IBM、PM，在肌肉活检中使用LC3 面板和TDP-43 抗体：LC3 临界值＜14% FS 可以帮助排除IBM，而TDP-43＞7% FS 强烈支持IBM 诊断。由于TDP-43＞7%FS 对IBM 诊断具有很高的特异性，因此TDP-43 免疫组化可以在临床病史无法区分或病情不典型的情况下使用[14]。同时，有学者研究得出，IBM 与PM 患者体内TDP-43、LC3 表达水平不相同，且IBM患者体内TDP-43、LC3 表达水平明显较高，因此，临床中可采用鉴别TDP-43、LC3 的方法来区分两种疾病[15]，与本研究结论一致。

综上所述，TDP-43、LC3 在IBM 骨骼肌标本中更易表达，可作为与PM 鉴别诊断的指标之一。