温阳散纤汤对博来霉素诱导的肺间质纤维化小鼠肺组织中羟脯氨酸及转化生长因子-β1含量的影响

朱晓龙 邱念念 狐启贵

贵州中医药大学第一附属医院呼吸科，贵州贵阳 550001

特发性肺间质肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种由多种原因引起的慢性纤维化肺疾病，会使患者弥散功能降低、通气/血流比例失衡，最终心肺衰竭致死[1-3]。近些年研究发现IPF 发病率呈上升趋势，且致死率高，也无有效的根治措施，因此成为全球共同关注的医学热点问题[4-5]。肺移植是目前IPF唯一有效的治疗方法，药物治疗虽然能延缓肺功能下降速度，但无法终止病情，因此治疗效果尚不乐观[3]。祖国医学将IPF 归为“肺痹”“肺痿”范畴，认为其为本虚标实之证，痰浊、瘀血为其病理因素[6-7]，因此以温阳为主治疗IPF，均取得一定疗效[8]。温阳散纤汤为本课题组临床经验方，以往研究显示此方剂中单药对肺纤维化具有显著改善作用[6-7]，但对于复方在肺纤维化中的研究较少，因此本课题组将进一步探讨其作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

18 只C57BL/6 小鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[动物许可证号：SCXK（湘）2016-0002]，大鼠在25℃室温下自由饮食和摄水，所有动物实验已经通过贵州中医药大学第一附属医院动物伦理委员会通过。

1.2 主要仪器与试剂

小鼠羟脯氨酸（Hyp）酶联免疫吸附试剂盒（酶免生物技术有限公司，批号：MM-0308M1）；小鼠转化生长因子-β1（TGF-β1）酶联免疫吸附试剂盒（酶免生物技术有限公司，批号：MM-0135M1），温阳散纤汤（广东一方制药有限公司，批号：0139573621629）；盐酸博来霉素（北京索莱宝科技有限公司，批号：801G023）；甲基泼尼松龙（MACKLIN，批号：C10125981）；RT-6100酶标仪（Rayto 公司）。

1.3 实验分组与处理

将18 只小鼠随机分为六组，即模型组，温阳散纤汤低、中、高剂量组，阳性组，正常组，假手术组，每组小鼠3 只。

1.3.1 造模 除正常组及假手术组外，其余几组小鼠按照如下操作进行造模：小鼠4%水合氯醛麻醉后，取仰卧位固定于操作台上，颈部剃毛并用碘氟消毒后，沿着颈部正中做1 cm 切口，钝性分离气管前组织使气管暴露，然后迅速向小鼠气管内注入5 mg/kg 博来霉素0.2～0.3 ml，注射后使小鼠直立并左右旋转，以使博来霉素在肺组织内均匀分布，最后无菌条件下缝合皮肤。假手术组小鼠以与造模同样方法向气管内注入0.3 ml 生理盐水[9-11]。

1.3.2 模型组处理 灌以等体积的生理盐水，每日1次，共4 周。

1.3.3 温阳散纤汤组处理 温阳散纤汤低、中、高剂量组在造模后第2 天开始每日以5.6625、11.3250、22.6500 mg/（kg·d）小鼠体重灌胃，每日1 次，共4 周。

1.3.4 阳性组处理 以甲基泼尼松龙15 mg/（kg·d）小鼠体重腹腔注射，每日1 次，共4 周。

1.3.5 正常组处理 灌以等体积的生理盐水，每日1次，共4 周。

1.3.6 假手术处理 灌以等体积的生理盐水，每日1次，共4 周。

1.4 观察指标

实验结束后取小鼠右肺组织用于Hyp 及TGFβ1 含量的测定，严格按照HYP、TGF-β1 试剂盒说明书通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定Hyp、TGF-β1含量。

1.5 统计学方法

应用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，所有实验重复3 次，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组之间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

模型组的Hyp 及TGF-β1 含量高于正常组及假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；温阳散纤汤低、中、高剂量组及阳性组的Hyp 及TGF-β1 含量低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；温阳散纤汤中、高剂量组及阳性组的Hyp 及TGF-β1 含量高于温阳散纤汤低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）；温阳散纤汤高剂量组及阳性组的Hyp 及TGF-β1 含量低于温阳散纤汤中剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1～2、表1）。

图1 各组小鼠肺组织中Hyp 含量测定情况的比较

图2 各组小鼠肺组织中TGF-β1 含量测定情况的比较

表1 各组小鼠肺组织中Hyp 及TGF-β1 含量测定情况的比较（±s）

表1 各组小鼠肺组织中Hyp 及TGF-β1 含量测定情况的比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.05；与假手术组比较，+P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与低剂量组比较，△P＜0.05；与中剂量组比较，□P＜0.05

正常组（n=3）假手术组（n=3）模型组（n=3）温阳散纤汤低剂量组（n=3）温阳散纤汤中剂量组（n=3）温阳散纤汤高剂量组（n=3）阳性组（n=3）F 值P 值2.14±0.21 2.31±0.23 6.06±0.60*+1.63±0.16#2.77±0.27#△2.45±0.21#△□2.00±0.20#△□25.328 0.012 75.64±7.52 73.01±7.30 102.28±10.20*+59.86±5.99#95.69±9.56#△69.98±7.01#△□65.19±6.52#△□18.653 0.005组别 Hyp（μg/ml） TGF-β1（ng/ml）

3 讨论

温阳散纤汤是本课题组的临床经验方，以补骨脂、熟地黄、黄精、淫羊藿、黄芪、麦冬为主方，在佐以川芎、丹参、当归、地龙，诸药合用，共奏益肺活血、纳气平喘，扶正祛邪之功效[6-7]。同时以往研究显示此方剂中单药对肺纤维化具有显著改善作用，如黄芪水提物可降低肺组织中Hyp 的含量，抑制TGF-β、血管内皮生长因子（VEGF）表达水平，从而改善小鼠肺纤维化的程度[12]。丹参酮ⅡA 通过iNOS 通路调控下游炎症因子的释放，从而缓解小鼠肺纤维化[13]。麦冬可抑制肺纤维化大鼠肺组织基质金属蛋白酶9（MMP-9）和金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP-1）的合成及分泌，调节两者的比值，这可能是其抑制肺纤维化形成的机制之一[14]。当归对大鼠弥漫性肺间质纤维化有明显的治疗作用，与抑制NF-κB 活性及下调TGF-β1表达有关[15]。且本课题前期已经证实此方能显著的改善IPF 小鼠肺组织病理变化，但具体机制尚未明确，因此本研究将进一步探讨温阳散纤汤对IPF 小鼠改善作用的相关机制。

Hyp 是机体胶原蛋白成分的一种，占胶原蛋白氨基酸总量的13%，而且几乎所有的Hyp 都存在于胶原蛋白中，因此Hyp 的含量能够反映组织中胶原的代谢情况，测定肺组织中Hyp 的含量能够反映胶原的沉积情况，也能够反映药物的治疗效果[12]。TGF-β 是目前与IPF 纤维化最为密切相关的蛋白之一，是公认的开关性细胞因子，哺乳动物中只存在前3 种亚型，其中TGF-β1 在哺乳动物组织中含量最高，与细胞、组织的纤维化的发生最为密切。TGF-β 通过与其受体（Ⅰ型受体：TβRⅠ，Ⅱ型受体：TβRⅡ，Ⅲ型受体：TβRⅢ）相互结合，将信号传递给下游底物Smad 蛋白家族，进而调控上皮-间质转化、促组织纤维化、促血管生成、促肿瘤的免疫逃逸、抑癌和促癌等多种生理病理过程，因此靶向TGF-β1 及其受体的小分子抑制剂已成为多种疾病如恶性肿瘤及组织纤维化的治疗过程[16-18]。同时有研究显示，Hyp 及TGF-β1 在小鼠肺纤维化中高表达，抑制Hyp 及TGF-β1 表达量的提高对于小鼠肺纤维化的改善具有显著促进作用[12，19-20]。因此本研究采用ELISA 法检测温阳散纤汤对IPF 小鼠肺组织中Hyp 及TGF-β1 含量的影响，结果显示，与模型组比较，温阳散纤汤低、中、高剂量组能降低Hyp及TGF-β1 含量，进而改善IPF 小鼠肺组织纤维化。而且ELISA 结果还显示，温阳散纤汤中、高剂量组对Hyp 及TGF-β1 含量的抑制作用效果低于低剂量组，温阳散纤汤高剂量组对Hyp 及TGF-β1 含量的抑制作用效果高于中剂量组，从而提示温阳散纤汤对IPE 小鼠纤维组织中Hyp 及TGF-β1 含量的抑制作用具有剂量依赖性。以往研究也证实此方单药中黄芪水提物、当归、地龙均可通过降低小鼠或大鼠肺组织中Hyp、TGF-β 表达水平，进而改善小鼠肺纤维化的程度[12，20-21]。也间接地证实了温阳散纤汤对IPF小鼠的改善作用与降低肺组织中Hyp、TGF-β 表达水平有关。

综上所述，温阳散纤汤低、中、高剂量能降低IPF小鼠肺组织中Hyp 及TGF-β1 含量，且具有剂量依赖性，从而说明一定剂量范围的温阳散纤汤通过降低Hyp、TGF-β 表达水平进而改善IPF 小鼠肺组织纤维化。