畲药“十二时辰”醇提液皮肤用药的毒性实验研究

周春权 赵 立 蒋 畅 胡 娟,2▲

1.福建省中医药科学院，福建福州 350003；2.福建中医药大学药学院，福建福州 350122

“十二时辰”为毛茛科铁线莲属下的一个变种植物重瓣铁线莲Clematis florida Thunb.var.plena D.Don的干燥根[1]。在《福安畲医畲药》书中有详细记载，其味温辛，主要功效为活血止痛、通经活络、祛风除湿、利尿、解毒，主治跌打损伤，关节肿痛，虫蛇咬伤[2]。“十二时辰”在畲族民间应用广泛，其花用来泡水代茶饮，其根用来泡酒为习用药，药液作为抹剂，对跌打损伤，关节肿痛等效果良好。“十二时辰”成为福安畲族具有鲜明地方特色的民族药。本实验室曾对“十二时辰”根用水煎煮，煎煮液给小鼠灌胃，发现其急性毒性的半数致死量（LD50）为60.08g/kg[3]。但是对其根用乙醇提取的醇提液，在皮肤上用药，毒性又将怎样呢？为此参照“中药药理研究方法学”皮肤用药毒性试验方法[4]，本研究进行了一系列的安全性实验，即皮肤用药急性毒性、试验皮肤刺激性试验和皮肤过敏试验，现报道如下。

1 材料与试剂

1.1 实验动物

新西兰家兔（上海市松江区松联实验动物场，20170008000087），雌雄各半，体重为（1.5±0.2）kg；豚鼠（上海市松江区松联实验动物场，311616700001569），雌雄各半，体重为（250±50）g。

1.2 实验药物

“十二时辰”醇提液：生药由闽东畲族青草药发展协会提供，经福建中医药大学药学院范世明教授鉴定为毛茛科植物重瓣铁线莲的干燥根。醇提液制备，用65%的乙醇加热回流提取，过滤，滤液减压浓缩成每毫升含生药2.0g的醇提液备用。

1.3 试剂

诗妃脱毛膏（广州诗妃生物科技有限公司，PSHG028）；2，4-二硝基氯代苯（上海试剂一厂，批号：20050216）。

2 方法与结果

2.1 “十二时辰”皮肤用药急性毒性实验

2.1.1 分组与给药 通过预试验，未发现有明显的毒性反应，则按照最大浓度最大耐受量法的原则进行家兔急性毒性实验。将家兔随机分成三组，即空白对照组（赋形剂）、完整皮肤给药组和破损皮肤给药组，每组各6只，雌雄各半。实验前24h，先用电动剃毛刀在背部剃毛，再用诗妃脱毛膏涂抹在背部脱毛，脱毛区面积约为150cm2。破损皮肤组的制作方法：先用75%酒精消毒，再用无菌刀片在背部脱毛区划“井”字，以渗血为度。

分别在各组家兔的脱毛区域均匀涂抹相应的药物，然后用医用纱布包扎固定。上午涂1次，6h后再涂1次，每次每只涂5mL，剂量约为12.5g/kg原药材。给药后详细观察并记录动物的死亡情况、体重、皮毛、饮食、呼吸、二便、眼睛、黏膜、行为改变、自主活动改变情况，连续观察2周。

2.1.2 实验结果 在观察期间，动物无死亡，体重、皮毛、饮食、呼吸、二便、眼睛、黏膜、行为、自主活动均正常。“十二时辰”皮肤用药12.5g/kg原药材，相当于成人（以成人体重60kg计算）日用剂量为250g，未见毒性反应。见表1。

表1 “十二时辰”皮肤用药急性毒性实验结果

2.2 皮肤用药刺激实验

2.2.1 分组与给药 根据“十二时辰”临床用药特点，本实验采用同体左右侧自身对比多次给药皮肤刺激实验，健康成年新西兰家兔，雌雄各半，分为四组，即“十二时辰”高剂量（1.0g/mL）完整皮肤组、破损皮肤组、“十二时辰”低剂量（0.5g/mL）完整皮肤组、破损皮肤组，每组各6只。于给药前24h用电推剪在背部脱毛，脱毛面积约150cm2。破损皮肤组的制作方法：先用75%酒精消毒，再用无菌刀片在背部脱毛区划“井”字，以渗血为度。使左右两侧皮肤的破损程度基本一致。每只动物分笼饲养，左侧脱毛区涂不同浓度的“十二时辰”醇提液2mL，右侧涂等量的基质作为对照，医用纱布固定，连续涂抹7d。

2.2.2 观察指标[4-5]末次给药次日，用温水把残留的受试药物轻轻搽洗去除，观察涂抹部位在去除受试物后的1、24、48、72h有无红斑和水肿等反应情况。再连续观察1周。根据皮肤刺激反应红斑和水肿分别评分，最高总分值为8分。评分标准如下：0分，无红斑、水肿；1分，勉强可见轻度红斑、水肿；2分，明显可见中度红斑、水肿；3分，重度红斑、水肿（皮肤隆起约1mm，轮廓清晰）；4分，紫红色红斑并有焦痂形成（皮肤隆起约1mm以上并有扩大，严重水肿）。根据皮肤刺激评分来计算刺激性指数，刺激性指数平均值=（刺激反应分值／动物总数），皮肤刺激性强度评价标准如下：无刺激性，刺激性指数平均值为0～0.49；轻度刺激性，刺激性指数平均值为0.50～2.99；中度刺激性，刺激性指数平均值为3.00～5.99；重度刺激性，刺激性指数平均值为6.00～8.00。

2.2.3 实验结果 对高剂量组、低剂量组的完整皮肤和破损皮肤进行刺激实验，根据皮肤刺激反应红斑和水肿评分标准，以及皮肤刺激性强度评价标准，见表2。由实验结果可见，高低剂量组家兔完整皮肤和破损皮肤末次给药24h后，在观察期内均未见红斑和水肿情况，也未观察到出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄等情况。故认为“十二时辰”无明显皮肤刺激性。

表2 “十二时辰”家兔皮肤刺激实验结果（分）

2.3 “十二时辰”皮肤用药过敏实验

2.3.1 分组与给药 将豚鼠按体重性别随机分成四组，每组10只，雌雄各半，即“十二时辰”高剂量组（1.0g/mL原药材）、“十二时辰”低剂量组（0.5g/mL原药材）、空白对照组（基质）、阳性对照组（2，4-二硝基氯代苯，1%致敏浓度，0.1%激发浓度，临用时用丙酮配置）。豚鼠于给药前24h先用电推剪在两侧背部脱毛，再用诗妃脱毛膏脱毛，每侧脱毛区面积约3cm×3cm。致敏接触：取受试物0.2mL/只均匀涂在动物左侧脱毛区，用适宜方法固定，先覆以聚乙烯薄膜，防止液体挥发，持续6h。第7、14天，按上述方法各重复一次。空白基质对照组和阳性对照组方法同上。激发接触：于末次给受试物致敏后14d，将受试物0.1mL/只涂于豚鼠背部右侧脱毛区，6h后去掉受试物。用温水或无刺激性溶剂去除残留受试物，即可观察，然后于24、48、72h再次观察皮肤过敏反应情况，空白基质对照组和阳性对照组方法同上。

2.3.2 观察指标[4-5]实验结果按照皮肤过敏反应红斑和水肿分别评分，最高总分值为8分。评分标准如下：0分，无红斑、水肿；1分，勉强可见轻度红斑、水肿；2分，明显可见中度红斑、水肿；3分，重度红斑、水肿（皮肤隆起约1mm，轮廓清晰）；4分，紫红色红斑并有焦痂形成（皮肤隆起约1mm以上或有水疱或破溃）。记录各时间皮肤过敏反应平均分值，平均反应值=（红斑形成总分+水肿形成总分）/动物总数。根据出现过敏反应的动物例数来计算致敏率并判断致敏强度，致敏性评强度价标准见表3。

表3 皮肤致敏性评价标准

2.3.3 实验结果 按照皮肤过敏反应红斑和水肿评分标准，各组的皮肤过敏反应结果见表4。根据皮肤致敏强度标准，各组的皮肤过敏反应致敏率及致敏强度结果见表5。由上表结果可见，“十二时辰”高、低剂量组及空白对照组，在去掉受试药后即刻以及24、48、72h观察期内，豚鼠皮肤均未出现红斑和水肿，也未观察到其他过敏反应。根据给药组与对照组豚鼠皮肤反应以及致敏率情况结果分析，可认为“十二时辰”为无致敏性药物。

表4 “十二时辰”皮肤过敏反应评分

表5 “十二时辰”皮肤过敏反应致敏率及致敏强度

3 讨论

畲药“十二时辰”来源于毛茛科植物重瓣铁线莲的干燥根。其同属植物习用品包括多种植物如威灵仙、东北铁线莲等，对其毒性研究已经取得了相当的进展，亦有丰富的临床报道[6-9]。本研究前期用“十二时辰”水煎液小鼠灌胃进行急性毒性实验，发现其有一定的毒性反应[3]。本研究结果表明，畲药“十二时辰”醇提液皮肤用药无急性毒性作用。在此基础上，本研究又对其醇提液进行小鼠灌胃急性毒性实验，发现其醇提液经内服后，也有一定的毒性作用，其毒性比水煎剂要大一些。根据化学物质的急性毒性分级标准，该药材虽属低毒药材。但不管是水煎剂还是泡酒制品，都不宜长期过量服用。

目前对于畲药“十二时辰”的研究还不够深入，也不够全面，还处在初级阶段，主要还是集中在畲药“十二时辰”的生药学鉴别[10]和生药鉴定[11]以及其挥发油的分析[12]，还有就是从园艺观赏价值方面展开，作为观赏花卉，有玫瑰红、粉红、紫色、绿色和白色等花色。在园林和栽培技术研究方面也有许多报道[13-15]。畲药“十二时辰”的药理作用如何，其在活血止痛、通经活络、祛风除湿方面的功效如何？还需要继续验证，也是今后进一步研究开发的方向。

对畲药“十二时辰”进行成分、药理、药效、毒理等进行全面的分析研究，既是挖掘整理、开发利用民族民间医药的需要，也是促进闽东北地区少数民族乡村经济建设的需要，对人民健康、经济发展和地方社会进步有着较大的意义。