姜黄素通过FoxO3a/Wnt信号途径抑制去卵巢大鼠骨质疏松的作用研究

杨青坡 王法正 邱 红 李 路 杨化群 穆合塔尔·麦麦提热夏提

1.新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院运动医学科，新疆喀什 844000；2.新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院护理部，新疆喀什 844000

骨质疏松症的发病机制虽然复杂，但仍以氧化应激为主[1-2]。近些年，关于叉头框蛋白O（FoxO）通路和抑制分泌型糖蛋白（Wnt）通路在氧化应激介导的骨质疏松中的研究逐渐增多[3-5]。因此，基于调控FoxO/Wnt通路的抗氧化活性物质成为抗骨质疏松药物研发的重中之重。姜黄素因抗氧化、抗炎、抗细菌、抗癌等特点而广泛用于治疗慢性炎症性疾病，在骨质疏松治疗中具有良好的应用前景[6-7]。本研究通过大鼠去卵巢骨质疏松模型，探究姜黄素对该模型的抑制作用机制，旨在完善骨质疏松病症的治疗方案，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究时间：2018年3月～2019年5月。

研究条件：（1）在取得南方医科大学南方医院实验动物伦理委员会批准（伦理审批号：NFYY-2019-46）情况下进行研究；（2）本次动物实验的开展参照美国卫生部颁布的《实验动物使用和关爱指南》受到了人道待遇（NIH颁布86-23，1986年修订）；（3）研究中所选择的SD大鼠均购自南方医科大学实验动物中心，并且具备实验动物生产许可证号[SCXK (粤)2006-0015]。

研究对象：SD大鼠，均为雌性，平均体重（240.0±9.8）g。

1.1.1 药物及试剂 姜黄素（广州宝策生物科技有限公司，纯度98%，生产批号：C20164）；降钙素（CT）；大鼠骨钙素（BGP）；丙二醛（MDA）；过氧化氢酶（CAT）；核转录因子-B受体活化因子配体（RANKL）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（广州宝策生物科技有限公司，生产批号分别 为：20181525、20181481）；骨 保 护 素（OPG）；nti-β-catenin、anti-FoxO3a及anti-β-Actin抗体（美国Cell Signaling Technology公司，货号分别为：12547L、12772S、12815P）；a二氯荧光素二乙酸盐DCFH-DA（美国Sigma-Aldrich公司，货号：13029S）。

1.1.2 仪器 858Mini Bionix型材料测试系统（美国MTS公司）；Infinite M200酶标仪（芬兰Thermo公司）；Lunar Prodigy DEXA骨密度（美国GE公司）；半自动图象分析仪（美国OsteoMesure公司）；Z-323型高速冷冻离心机（德国Hermle公司）；Mx3005P QPCR System（美国CStratagene公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分组 选取32只雌性SD大鼠，参照文献方法[8]，将其中24只大鼠的双侧卵巢摘除，且复制为绝经后大鼠骨质疏松动物模型（模型组），其余8只大鼠无需任何处理（对照组）。术后0.5年，按照电脑随机分组法对模型组进行分组，即模型1组（8只）、白藜芦醇组（8只）、姜黄素组（8只），其中白藜芦醇组体重为5mg/（kg·d），姜黄素组体重为20mg/（kg·d），按给药体积为10mL/kg，对白藜芦醇组、姜黄素组分别给予相应剂量姜黄素（广州宝策生物科技有限公司，生产批号：C20164）及白藜芦醇（陕西慈缘生物技术有限公司，纯度98%）灌胃；对照组、模型1组给予同体积的0.5%羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na），1次/d，连用8周。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 骨代谢指标检测 给药后，准确测量大鼠体重，予以麻醉（10%水合氯醛腹腔注射），采集股动脉血，离心处理，留取血清，保存在-80℃冰箱。采用ELISA法测定血清CT、OPG、BGP、RANKL含量，操作按说明书进行[9]。

1.2.2.2 测定骨密度、骨生物力学 处死大鼠后，明确右股骨、胫骨、第4腰椎椎体的具体位置，然后将其分离，再选择股骨全段/腰椎全段为测量点，使用骨密度仪测定骨密度（BMD）[10]。按照跨距15mm、加载速度0.01mm/s，采用三点弯曲法完成胫骨生物力学测定，注意准确记录胫骨最大载荷、最大应力[11]。

1.2.2.3 氧化应激指标检测 分离血清后按操作说明书行血清MDA、CAT、SOD水平的含量测定。大鼠胫骨骨髓组织采用荧光探针2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）检测活性氧（ROS）水平[12-13]。

1.2.2.4 Western blot检测 分离左股骨组织，使用不连续丙烯酰胺凝胶电泳对目的蛋白进行分离，然后转膜固定，5%脱脂牛奶的TBST缓冲液封闭1h，加入一抗（anti-β-catenin及anti-FoxO3a，1∶2000）后4℃孵育摇晃过夜，TBST冲洗孵育二抗（1∶3000）后，室温孵育2h后电化学发光法（ECL）曝光显色，β-Actin作为内参。Alpha图像分析软件对目标带光密度值行半定量分析。

1.2.2.5 QPCR检测 采用Gadd45α和Axin2特异性引物进行聚合酶链式反应（PCR）。

1.3 统计学方法

选择SPSS17.0统计学软件为处理工具，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对骨质疏松大鼠血清骨代谢指标的影响

模型1组 的CT、OPG水 平低于 对 照组，但BGP、RANKL水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；姜黄素组、白藜芦醇组的CT与OPG水平高于模型1组，但BGP、RANKL水平低于模型1组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 姜黄素对骨质疏松大鼠血清骨代谢指标的影响（±s，μg/L）

表1 姜黄素对骨质疏松大鼠血清骨代谢指标的影响（±s，μg/L）

组别 n CT OPG BGP RANKL对照组 8 2.54±0.22 902.84±28.72 0.84±0.12 0.34±0.11模型1组 8 1.29±0.24 864.29±30.14 1.19±0.17 0.67±0.09白藜芦醇组 8 2.31±0.13 996.34±29.76 0.93±0.13 0.45±0.15姜黄素组 8 2.29±0.36 951.42±27.17 0.89±0.09 0.51±0.07 F/P 6.562/0.001 10.731/0.001 20.528/0.001 17.794/0.001 q/P对照组与模型1组比较 11.482/0.001 3.725/0.020 5.822/0.001 4.710/0.001 q/P白藜芦醇组与模型1组比较 11.029/0.001 19.392/0.001 4.621/0.004 6.183/0.003 q/P姜黄素组与模型1组比较 5.802/0.001 6.103/0.001 7.602/0.001 8.815/0.001

2.2 姜黄素对骨质疏松大鼠骨密度和骨生物力学的影响

模型1组的腰椎及股骨的BMD、胫骨的最大载荷、最大应力均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；姜黄素组、白藜芦醇组的腰椎及股骨的BMD、胫骨的最大载荷、最大应力均高于模型1组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 姜黄素对骨质疏松大鼠骨密度和骨生物力学的影响（±s）

表2 姜黄素对骨质疏松大鼠骨密度和骨生物力学的影响（±s）

组别 n 腰椎BMD（mg/cm2） 股骨BMD（mg/cm2） 胫骨的最大载荷（N） 最大应力（MPa）对照组 8 200.54±19.34 193.86±24.61 159.32±10.68 224.52±19.35模型1组 8 108.33±20.25 96.78±17.62 99.25±17.36 128.33±15.48白藜芦醇组 8 167.17±14.08 157.11±19.52 146.85±19.51 179.81±17.39姜黄素组 8 159.62±17.53 136.78±20.08 134.76±15.47 160.42±23.57 F/P 21.386/0.001 15.269/0.001 20.591/0.001 12.577/0.001 q/P对照组与模型1组比较 4.893/0.001 7.026/0.001 9.491/0.001 11.358/0.001 q/P白藜芦醇组与模型1组比较 7.562/0.001 8.901/0.001 11.531/0.001 3.702/0.001 q/P姜黄素组与模型1组比较 6.782/0.001 9.384/0.001 4.781/0.001 7.207/0.006

2.3 姜黄素对骨质疏松大鼠氧化应激指标的影响

模型1组的MDA、ROS水平高于对照组，但SOD、CAT水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；姜黄素组、白藜芦醇组的MDA及ROS水平低于模型1组，但SOD和CAT水平高于模型1组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 姜黄素对骨质疏松大鼠氧化应激指标的影响（±s）

表3 姜黄素对骨质疏松大鼠氧化应激指标的影响（±s）

组别 n MDA（μmol/L） SOD（U/mL） CAT（U/mL） ROS（AFU，×1000）对照组 8 3.35±1.03 128.46±40.73 35.92±6.48 562.77±163.53模型1组 8 7.94±1.14 70.56±24.51 21.03±4.05 2784.81±301.05白藜芦醇组 8 5.37±0.98 105.08±17.31 32.96±3.82 1342.98±186.54姜黄素组 8 5.81±1.17 100.47±15.79 30.69±4.11 1499.37±175.41 F/P 35.901/0.001 6.835/0.003 17.902/0.001 56.978/0.001 q/P对照组与模型1组比较 7.904/0.001 4.826/0.004 7.018/0.001 17.582/0.001 q/P白藜芦醇组与模型1组比较 9.458/0.001 3.948/0.006 19.492/0.001 23.639/0.001 q/P姜黄素组与模型1组比较 4.026/0.002 4.847/0.012 18.773/0.001 16.594/0.001

2.4 姜黄素对FoxO3a/Wnt通路的影响

模型1组大鼠骨组织中FoxO3a蛋白及Gadd45α基因的表达高于对照组，但β-catenin蛋白和Axin2基因的表达低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；姜黄素组及白藜芦醇组FoxO3a蛋白、Gadd45α基因的表达低于模型1组，但β-catenin蛋白、Axin2基因的表达高于模型1组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 姜黄素对骨质疏松大鼠FoxO3a/Wnt通路的影响（±s）

表4 姜黄素对骨质疏松大鼠FoxO3a/Wnt通路的影响（±s）

组别 n FoxO3a/β-Actin Gadd45α β-catenin/β-Actin Axin2对照组 8 0.16±0.03 1.01±0.12 0.71±0.02 1.03±0.21模型1组 8 0.29±0.08 7.83±1.76 0.45±0.09 0.29±0.14白藜芦醇组 8 0.18±0.03 2.53±0.97 0.67±0.07 0.77±0.16姜黄素组 8 0.17±0.06 2.31±0.82 0.58±0.02 0.93±0.24 F/P 29.658/0.001 32.014/0.001 27.926/0.001 47.173/0.001 q/P对照组与模型1组比较 5.821/0.001 9.692/0.001 6.362/0.001 7.337/0.001 q/P白藜芦醇组与模型1组比较 7.236/0.003 10.552/0.001 9.632/0.001 7.559/0.001 q/P姜黄素组与模型1组比较 3.936/0.004 32.015/0.001 6.269/0.001 6.558/0.001

3 讨论

作为常见的一种全身性骨病，骨质疏松症具有较高患病率，统计发现我国超过60岁老年人中骨质疏松症的发生率为36%[14-15]。该病的发生与多种原因有关，但介于伴有骨代谢病理变化，所以普遍认为与氧化应激介导有关[16]。然而，目前尚未寻到通过抗氧化应激机制可以起到抗骨质疏松作用的药物。因此，衰老与氧化应激转成为抗骨质疏松的焦点。

近些年，姜黄素的抗氧化作用机制得到了广泛证实[17-18]。而白藜芦醇对衰老进程具有明显的延缓作用，再加上维持BMD特点[19]。所以，建议对其抗骨质疏松方面研究展开深入探索，但关于白藜芦醇的非靶标作用较少，导致其药学应用受限。基于此，本研究选择白藜芦醇为对照组，比较探究姜黄素的应用效果，重点分析其在抗氧化应激调控下对骨质疏松的作用机制。

BMD、骨生物力学指标常用于预测骨折危险性、评定骨脆性，当前者水平低、后者改变，即可体现出药物对骨质疏松症的治疗效果。CT、BGP是用于评价骨代谢的常用指标之一，两者水平变化呈正相关。OPG、RANKL参与骨重建过程，并且是连接骨形成、骨吸收的关键分子，而OPG是RANKL的诱饵受体，二者结合可抑制破骨细胞形成[20-21]。本研究结果显示，模型1组血清CT、OPG水平较对照组低，但BGP、RANKL水平明显增高，且呈下降趋势发展，表明姜黄素、白藜芦醇能够抑制卵巢诱导大鼠上述指标的改变。可见，姜黄素、白藜芦醇具有不同程度的抗骨质疏松作用。

MDA是评估脂质过氧化作用的敏感性标志物。CAT、SOD则是体内抗氧化体系的主要分子。活性氧自由基（ROS）是机体内正常新陈代谢所产生的一类氧化剂。如果ROS积累过多/抗ROS缺陷，便会造成机体氧化还原系统失衡[22]。本研究结果得出，模型1组MDA、ROS水平升高，但SOD、CAT水平降低，表明骨质疏松易增加骨组织中氧化应激水平，本研究结果与文献报道基本一致[23]，提示使用姜黄素、白藜芦醇有助于对抗骨质疏松引起的氧化应激损伤。

本研究结果还显示，骨质疏松大鼠骨组织中Gadd45α及FoxO3a水平明显升高，提示上调的FoxO3a通路可促进氧化应激加重，增加骨质疏松风险。通过使用姜黄素，可有效降低二者的表达水平，获取良好的抗骨质疏松效果，考虑与通过抑制FoxO3a通路、缓解氧化应激有关。Wnt/β-catenin通路属于骨内稳态通路，其通过关键信号分子β-catenin调控骨形成的过程，通过激活Wnt/β-catenin通路，抑制氧化应激诱导的骨质疏松。

作为Wnt通路的靶基因，Axin2表达水平能够直接反映Wnt信号通路的整体活性。本研究结果提示，骨质疏松能够抑制Wnt/β-catenin通路，而姜黄素可以显著升高Axin2、β-catenin表达水平，进一步说明激活的FoxO3a通路可能间接抑制Wnt/β-catenin通路，诱发骨质疏松，而姜黄素发挥抗骨质疏松作用的部分干预机制与降低Fox03a转录活性、抑制解除Wnt通路有关。

总之，姜黄素的应用价值较高，能够通过抑制缓解氧化应激反应达到调节FoxO3a/Wnt通路的目的，进而延缓卵巢大鼠骨质疏松进展，改善预后。