龙葵有效部位总生物碱的提取、含量测定及抗肿瘤作用的初步研究*

卢芯王桂玲王琢马文青张健

山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016

龙葵(Solanum nigrum L.)为茄科茄属的草本植物，又称苦葵、黑天天、野葡萄、天泡草等，性寒、 味苦、微甘，有小毒。具有活血化瘀、利水消肿、清热解毒等功效。龙葵中含有多种成分如：生物碱、多糖、维生素、蛋白质等，生物碱类成分是龙葵的主要成分，已有文献报道从龙葵中分离出的生物碱类成分有茄碱、澳洲茄碱、澳洲茄边碱、龙葵碱等[1-2]，这些成分的存在赋予龙葵的抗肿瘤、抗过敏、抗菌等多样的生物活性[3-5]。本研究是以龙葵有效部位总生物碱作为研究对象，先采用乙醇回流提取，利用酸性染料比色法对龙葵中总生物碱进行了含量测定，然后以MTT法及细胞形态学观察法研究不同浓度的龙葵总生物碱对ECA-109食道癌、MCF-7乳腺癌细胞的抑制作用。本研究为龙葵有效部位总生物碱的抗癌应用提供实验依据，同时也为龙葵的进一步开发和利用提供了参考。

1 材料

1.1试剂

龙葵(购自山东菏泽泰山中药饮片有限公司，经山东第一医科大学药学院中药学教研室高红莉教授鉴定为茄科茄属植物龙葵 Solanum nigrum L.的全草)；澳洲茄碱(批号：17111601，北京百欧博伟生物技术有限公司)；溴甲酚绿(上海广诺化学科技有限公司)；MTT(Amresco 0793)、胰蛋白酶EDTA消化液(20190329)、胎牛血清(20161017)、DMEM/HIGH GLUCOSE(AE24921270)、RNase A(20190411)、PI染色液(20190420)均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2肿瘤细胞株

ECA-109食道癌和MCF-7乳腺癌细胞株均购自中国科学院上海生命科学研究院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.3仪器

RE-52A 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；UV-5200紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)； TGL-16G 台式高速离心机(湖南星科科学仪器有限公司)。

2 实验方法与结果

2.1龙葵中总生物碱的含量测定

2.1.1龙葵中总生物碱的提取与精制 准确称取干燥龙葵100g，加41倍量的63.7%的乙醇，回流提取2次，每次55min，抽滤，滤液合并，回收乙醇，浓缩至浸膏状，干燥、称重。

称取适量浸膏，用适量体积10%乙酸超声溶解后，用三氯甲烷萃取，直至三氯甲烷层近乎无色。萃取后的溶液，用氨水调PH=910，再用三氯甲烷萃取，直至三氯甲烷层近乎无色。合并三氯甲烷层，回收三氯甲烷，干燥、称重，即得龙葵总生物碱。

2.1.2对照品和样品溶液的制备 称取2.5mg澳洲茄碱对照品及“2.1.1”项制备的龙葵总生物碱10mg，均用甲醇超声溶解分别定容至10mL的量瓶中，备用。

2.1.3缓冲溶液的制备 称取1.64g醋酸钠，蒸馏水超声溶解定容至100mL量瓶中，即得0.2mol/L的醋酸钠溶液，再量取1.8mL醋酸溶液，蒸馏水定容至100mL量瓶中，即得0.3mol/L的醋酸溶液。各量取1.20、2.65、3.70、5.90、7.90、8.60、9.10mL的醋酸钠溶液和8.80、7.35、6.30、4.10、2.10、1.40、0.80 ml的醋酸溶液分别置于10ml量瓶中，定容混匀，制备成PH分别3.8、4.2、4.4、4.8、5.2、5.4、5.6的缓冲溶液，备用。

2.1.4酸性染料的制备[6,7]称取0.05 g的溴甲酚绿置研钵中，加入2ml 0.05mol/L NaOH溶液研磨至完全溶解，蒸馏水定容至10 ml量瓶中，摇匀备用。精密量取已配好的溴甲酚绿溶液1 ml，置10 ml量瓶中，用PH为4.4的缓冲溶液定容，备用。

2.1.5测定条件的考察

2.1.5.1缓冲液PH的确定 精密量取“2.1.2”项对照品溶液7份，每份0.5 ml，分别加不同pH值配置的溴甲酚绿溶液1.5 ml，再加PH各为3.8、4.2、4.4、4.8、5.2、5.4、5.6的缓冲溶液4 ml，三氯甲烷2ml，振摇，静置10 min，再用同体积的三氯甲烷萃取直至三氯甲烷层近乎无色，合并三氯甲烷萃取液，定容至10 ml量瓶中。在415 nm波长处测定吸光度，吸光度值为0.558、0.568、0.715、0.502、0.485、0.482、0.507，表明pH为4.4时有最大吸收，所以选择pH为4.4的缓冲溶液。

2.1.5.2酸性染料用量的考察 精密量取“2.1.2”项对照品溶液溶液4份，每份0.5 ml，各加pH为4.4的缓冲溶液4.5、4、3.5、3 ml及PH为4.4缓冲溶液配置的溴甲酚绿溶液1、1.5、2、2.5 ml，其余操作同“2.1.5.1”项，吸光度值为0.543、0.737、0.736、0.713，表明溴甲酚绿溶液为1.5 ml时，吸收较大，此后吸收趋于稳定，所以选择溴甲酚绿溶液用量为1.5 ml。

2.1.5.3测定波长的选择 精密量取“2.1.2”项对照品溶液和样品溶液各0.5 ml，各加pH为4.4的缓冲溶液4 ml、溴甲酚绿溶液1.5 ml、三氯甲烷2ml，其余操作同“2.1.5.1”项，在200600 nm波长范围内扫描。结果表明对照品和样品溶液均在415nm处出现最大吸收，所以选择415 nm为测定波长。

2.1.5.4确定的最佳条件 根据以上测定条件的考察结果，确定缓冲溶液的pH为4.4，酸性染料的用量为1.5 ml，测定波长在415 nm处。

2.1.6标准曲线的绘制 精密量取“2.1.2”项对照品溶液0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 ml，各加pH为4.4的缓冲液4.5、4.2、4.1、4、3.9、3.8 ml，1.5 ml溴甲酚绿溶液、2 ml三氯甲烷，振摇，静置10 min，再用同体积三氯甲烷萃取至三氯甲烷层近乎无色，合并三氯甲烷萃取液，定容至10 ml量瓶中。在415 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程：A=2.964C-0.0061 。R2=0.999，表明澳洲茄碱在0.0075～0.0175 mg/ml范围内线性关系良好。

2.1.7方法学考察

2.1.7.1精密度试验 精密量取“2.1.2”项对照品溶液0.5 ml，加4 ml pH为4.4的缓冲溶液、1.5 ml溴甲酚绿溶液、2 ml三氯甲烷，振摇，静置10 min，再用同体积三氯甲烷萃取至三氯甲烷层近乎无色，合并三氯甲烷萃取液，定容至10 ml量瓶中。在415 nm波长处连续测定5次，结果RSD=0.796%，表明该方法精密度良好。

2.1.7.2重复性试验 按“2.1.1”和“2.1.2”项操作制备样品溶液5份，量取每份0.5 ml，按“2.1.7.1”项操作处理，结果RSD=0.248%，表明该方法重复性良好。

2.1.7.3稳定性试验 精密量取“2.1.2”项对照品溶液0.5ml，按“2.1.7.1”项操作处理，每隔5 min在415 nm处测定一次吸光度，30 min测得的RSD=0.932%，表明该方法稳定性良好。

2.1.7.4回收率试验 按“2.1.1”和“2.1.2”项操作制备样品溶液5份，量取每份样品溶液2 ml，按“2.1.6”项操作测定每份中生物碱的含量，再量取每份样品溶液2 ml，各加入对照品溶液2 ml，置于10 ml量瓶中甲醇定容，在415 nm波长处测定吸光度,结果如表1所示。

表1 回收率试验

2.1.7.5样品含量测定 准确称取龙葵3份，每份10g，按“2.1.1”项和“2.1.2”项操作处理，量取每份样品溶液0.5mL，按“2.1.5.1”项操作处理，按“2.1.6”项标准曲线计算龙葵中总生物碱平均含量为1.43%(RSD=0.321%)，表明该含量测定方法稳定、简便，重现性好。

2.2龙葵中总生物碱体外抗肿瘤作用的初步研究

2.2.1MTT法 待细胞培养24 h后，取对数生长期的ECA-109和 MCF-7细胞分别用胰酶消化后，用DMEM培养基(含有10%灭活新生小牛血清)调整细胞数。然后将细胞接种到96孔板中，每孔100l，培养24h，待细胞贴壁后，加人不同浓度的药液，使药物终浓度分别为 0、40(相当于生物碱浓度0.572μg /ml)、80(1.144μg /ml)、120(1.716μg /ml)、 160(2.288μg /ml)、200(2.86μg /ml)，每个浓度设6个复孔，空白对照组只加入含DMSO的培养基，阴性对照组只加入10l PBS。给药后继续在37℃、5%CO2条件下培养至预定时间，每孔加入MTT溶液20l，振荡混匀，继续培养4h后，弃掉各孔中上清液，每孔再加100μl DMSO，振荡溶解，用酶标仪于490 nm 处测定各孔的吸光度，计算细胞增殖抑制率，抑制率(%)= (1 -加药细胞平均吸光度值-空白组吸光度值 /对照组细胞平均吸光度值-空白组吸光度值) × 100%，结果如图1所示。

图1 不同浓度龙葵总生物碱对ECA-109和MCF-7细胞的抑制率

由图1可以看出，不同浓度的龙葵总生物碱对ECA-109食道癌和MCF-7乳腺癌细胞增殖均有抑制作用，24h抑制率可达70.80%、74.36%，且呈明显的量效关系。

2.2.2形态学观察 取生长状态良好，形态正常，适宜密度的细胞株接种于六孔板中，分别加入不同浓度的龙葵总生物碱溶液，培养一段时间后，用倒置显微镜观察各孔内细胞形态的变化。通过观察发现对照组的MCF-7乳腺癌和ECA-109食道癌的细胞贴壁生长，大小均匀，细胞间接触紧密，生长旺盛。而加药组细胞逐渐脱壁，细胞密度明显减小，大小不均匀，细胞间距变大，增殖变慢，且溶液浓度越高，细胞形态变化越明显。

3 结 果

3.1采用乙醇回流提取，三氯甲烷萃取，酸性染料比色法测定龙葵中总生物碱的含量，表明在0.0075～0.0175mg/ml范围内线性关系良好，R2=0.999，平均加样回收率为97.92%，RSD=1.96%(n=5)，测得龙葵中总生物碱的平均含量为1.43%。

3.2MTT法表明不同浓度龙葵总生物碱对食道癌ECA-109和乳腺癌MCF-7细胞增殖均有抑制作用，24h抑制率可达70.80%、74.36%，且呈明显的量效关系。经过不同浓度龙葵总生物碱处理后，大部分细胞形态发生变化，细胞密度明显减小，大小不均匀，细胞间距变大，增殖变慢。本研究为龙葵有效部位总生物碱的抗癌应用提供实验依据，同时也为龙葵的进一步开发和利用提供参考。