Kokumi肽的特性及其制备研究进展

黄煜燃,杨 娟,汪 薇,白卫东,*,曾晓房,黄文彪,陈 杰

(1.仲恺农业工程学院轻工食品学院,广东广州 510225; 2.佛山市海天(高明)调味食品有限公司,广东佛山 528500; 3.广东粤师傅调味食品有限公司,广东开平 529300)

食物在满足人们基本需求的同时,也可以带给人们心理上的愉悦享受。除了香味以外,滋味是评价食物感官质量的最重要特性。滋味物质通常是亲水性的小分子物质,这些小分子物质从食物提取到唾液中后,与舌头味蕾细胞上特定味觉受体相互作用,从而产生各种味觉[1-2]。酸、甜、苦、咸、鲜是人们广泛熟知的五种基本味觉[3],但随着人们对于食物味道的追求不断提高,单一的味觉特性已经不能满足人们的需求,且食物中的浓厚、饱满圆润、回味悠长和平衡协调等复杂特性无法用这五种基本味感来表达。早在1900年,日本科学家发现了这种具有复杂味感的活性物质,并将此味感定义为“kokumi”[4]。

呈味肽一般是对食品风味具有一定贡献的小分子寡肽类,根据其味觉特性又分为了酸味肽、甜味肽、苦味肽、咸味肽和鲜味肽五大类[5]。在人们的认识中,鲜味肽的概念容易与kokumi肽混淆。研究表明,鲜味肽具有增强食物咸鲜味和醇厚感等特点,但kokumi是形容更为复杂的味感,它强调食物的协调感、丰富度和持续度,属于口感的范畴,这是鲜味与kokumi味感最本质的区别[6-8]。Kokumi肽作为一种新型活性肽类物质,具有良好的味觉特性,能够影响食品的营养和感官质量[9-10],故成为近年来国内外的研究热点和新型调味剂开发的重点方向。

本文重点介绍了kokumi肽的来源、结构特性、味觉特性以及呈味机制等特性,加深对kokumi肽的系统认识和理解,并结合kokumi肽的制备方法进行综述,以期为kokumi肽的研究利用和进一步开发新型调味品提供理论依据和参考。

1 Kokumi肽的来源

“Kokumi”一词最早源自于日本,由于食品中的滋味十分复杂,无法用单一的基本味觉去描述如浓汤和发酵食品等优良风味。因此,人们习惯上用这一词来表达食品的浓厚感、丰富度、持续性、协调性和饱满圆润等一种综合性的味觉感受[11-12]。早在1990年,日本学者Ueda等[4]在大蒜的水提物中鉴定出赋予食品kokumi味感的物质主要是一些含硫化合物,如大蒜碱、S-甲基-L-半胱氨酸亚砜和γ-L-谷酰基-S-烯丙基-L-半胱氨酸等。1994年,该学者在洋葱提取物中同样发现了如γ-谷酰基-S-丙烯基-L-半胱氨酸亚砜和反-S-丙烯基-L-半胱氨酸亚砜等具有浓厚味感的含硫化合物[13]。同年,法国学者Roudot-Algaron等[14]从Comté奶酪中分离纯化了三种具有复杂、浓郁且略带咸鲜味和金属味的γ-谷氨酰二肽(γ-Glu-Phe、γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Leu),并认为这三种肽是赋予奶酪风味的关键物质。1997年,Ueda等[15]发现,当γ-谷胱甘肽(γ-L-Glu-L-Cys-Gly,GSH)添加到含有谷氨酸钠(MSG)和肌苷酸(IMP)的鲜味溶液后,鲜味溶液中的口感、厚度和连续性显著提升,并指出GSH是一种典型的kokumi肽。自此,越来越多的学者开始对kokumi肽进行研究和开发。

近年来,在许多食品中都能发现kokumi肽,包括γ-谷氨酰肽和一些小分子寡肽类等,主要来源于动物性食品,如河鲀、鸭肉、扇贝、牛骨髓,植物性食品,如菜豆、大豆、双孢蘑菇,以及发酵食品,如奶酪、发酵面团、发酵鱼、鱼酱、虾酱、酱油、酒精饮料和酵母提取物等。为了研究kokumi肽的特性,本文总结了文献已报道不同来源的kokumi肽的序列和呈味阈值,如表1所示。

2 Kokumi肽的特性

2.1 Kokumi肽的结构特性

Kokumi肽的呈味特性与其分子结构密切相关。通过统计发现,大部分kokumi肽为γ-谷氨酰肽类物质,Wang等[38]通过将暗纹东方鲀肌肉水解物进行超滤分级后,发现0.3～3 kDa组分的浓厚味感和鲜味特性比大于3 kDa组分明显,且进行美拉德反应后,其浓厚味感会更加强烈。此外,在三种酵母抽提物的kokumi物质研究中发现,导致其浓厚味感的主要滋味物质为<1000 kDa分子量的寡肽[23,39]。大量研究也证实了具有浓厚味活性的γ-谷氨酰肽类物质几乎都是γ-谷氨酰二肽和三肽类物质。Kokumi肽中官能团位置的差异也会明显影响其呈味效果。如Toelstede等[34]研究古达奶酪中的8种α-L-谷氨酰肽和γ-L-谷氨酰二肽时发现,只有γ-L-谷氨酰二肽具有浓厚味特性,而α-L-谷氨酰肽没有此作用。

除此之外,部分kokumi肽的末端连接了如Val、Ala、Leu、Met和Phe等疏水性氨基酸,当这些疏水性氨基酸残基位于肽链的C-端位置时,会产生苦味[40],但这些kokumi肽并没有呈现出苦味,反而呈现出浓厚、饱满和持久的风味特性。其原因可能是因为γ-谷氨酰化降低了肽的苦味,使它产生了更好的浓厚味感[41]。另一项研究也表明,γ-谷氨酰转肽酶的转肽反应可以降低氨基酸的苦味[42]。这说明了kokumi肽的呈味特性会受末端的疏水性氨基酸残基影响,但并不能决定其总体的呈味效果。此外,当肽类物质含有Cys的肽段时,会因氨基酸侧链基团上含有-SH而在舌尖上产生了轻微的收敛感,因而呈现出更低的味感阈值和显著的浓厚味感,说明了Cys残基对kokumi肽的味感具有重要影响[31]。

2.2 Kokumi肽的味觉特性

Kokumi肽本身是没有味觉活性的,几乎所有具有浓厚味活性的γ-谷氨酰肽类物质在水溶液中只会表现出轻微的涩味或苦味,这是由N-端的γ-谷氨酰基和C-端的氨基酸残基决定的[41]。研究表明,γ-Glu-Val-Gly和γ-Glu-Cys-Gly在甜味、咸味和鲜味等基本味觉溶液和鸡汤溶液中能显著增强其基本味觉效果并呈现出明显的浓厚味感[43-44]。Yang等[36-37]通过研究γ-谷氨酰肽的酶促合成和感官特性分析发现,γ-[Glu]n-Phe、γ-[Glu](n>1)-Val和γ-[Glu](n>1)-Met单独添加在水中时只有轻微的涩味,但当它们被添加到商业酱油和模拟鸡汤溶液中时,能够产生明显的浓厚味觉,并能显著增强商业酱油和鸡汤溶液的鲜味味觉。可见,只有将这些kokumi肽添加到含有两种或三种基本味觉物质的溶液中时才能呈现出浓厚味感,且能增强溶液中的咸鲜味感。这表明kokumi肽能有效协调其他基本味感,显著增强复合溶液的厚度、丰富度和味感持续性,具有协同增效作用。

表1 食品中kokumi肽的序列、来源及呈味阈值Table 1 The sequence,source and taste threshold of kokumi peptides in food

研究表明,kokumi肽还具有剂量-浓度效应。即在溶液中添加的kokumi肽必须达到一定浓度,才能使其表现出浓厚味;且由于其本身具有涩味,当其添加浓度过高时会引起其浓厚味味觉的减退。例如,来源于酵母提取物中的kokumi肽在浓度超过其阈值浓度的16倍时,其浓厚味感开始下降,而且Ala-Val、Tyr-Glu和Ala-Tyr在浓度分别达到26.4、16.1和19.8 mmol·L-1时才开始呈现出浓厚味感[23]。Yang等[36-37]在对γ-[Glu]n-Phe、γ-[Glu](n>1)-Val和γ-[Glu](n>1)-Met的研究中也发现,当这些γ-谷氨酰肽的浓度超过3 mmol·L-1时,能产生鲜味和浓厚感,但当剂量浓度超过5 mmol·L-1时,浓厚味感会减退并产生涩味。

2.3 Kokumi肽的呈味机制

目前的研究认为,kokumi肽具有激活钙敏感受体(calcium-sensing receptor,CaSR)的能力,从而产生浓厚味感[43,45,10]。CaSR位于味感细胞的膜表面,是属于典型的G蛋白偶联受体C家族的第二组成员,由1078个氨基酸残基组成[46-47]。早在2009年,San等[46]发现小鼠的味感细胞中存在CaSR,并首次证实了CaSR是引起哺乳动物浓厚味感的潜在味觉组织。此后,多位学者开始研究浓厚感味觉与CaSR之间的关联性。Kuroda等[45]研究发现,GSH、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Val、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Abu-Gly(Abu:α-氨基丁酸)和γ-Glu-Val-Gly等物质的浓厚味强度与CaSR活性呈显著正相关。此研究还发现,当加入CaSR特异性拮抗剂NPS-2143后,能显著降低GSH和γ-Glu-Val-Gly的味觉强度,这说明CaSR参与了kokumi物质的呈味效应。Yutaka团队的研究同样也证实了上述的结论,并且还发现CaSR不直接参与鲜味或甜味的信号传递,证明了表达CaSR的味觉细胞是区别于T1R3表达鲜味或甜味受体细胞的细胞亚群,是kokumi物质的主要检测器[10]。

此外,具有浓厚味活性的γ-谷氨酰肽的氨基酸序列可能对CaSR的激活有一定的影响。Amino等[48]通过研究具有浓厚味活性的γ-谷氨酰肽结构与CaSR活性的关系中发现,N-端为L-构型的γ-谷氨酰残基,且第二个残基连接的中等大小、脂肪族中性取代基的γ-谷氨酰二或者三肽具有很强的激活CaSR的能力。但是,由于氨基酸的排列顺序复杂多样,单一的排列规则无法代表具有浓厚味活性的γ-谷氨酰肽的氨基酸序列特点。因此,kokumi肽的浓厚味机制仍有待进一步研究。

3 Kokumi肽的制备方法

由于kokumi肽独特的呈味特性,含有kokumi肽的食用调味品生产日益受到人们的关注。根据现有的研究,kokumi肽的制备方法主要分为化学合成法、酶合成法和微生物发酵法。

3.1 化学合成法

化学合成法是以氨基酸为原料,利用一系列化学反应来进行肽键缩合的方法。该法主要集中在二肽和三肽的合成,特点是纯度高、稳定性好,但操作繁琐、反应复杂、产率低、价格昂贵,且制备过程中需要用到一些合成试剂如偶联剂和酰化试剂等,存在一定的毒副作用[49]。化学合成法多适用于纯度要求极高的kokumi肽的制备,其产物主要应用于实验室的分析检测,无法满足kokumi肽产业化生产的需求。

3.2 酶合成法

目前最常见的kokumi肽为γ-谷氨酰肽,多项研究报道该类kokumi肽是由生物酶合成的。酶合成法是利用酶制剂在特定的底物和反应条件下催化合成γ-谷氨酰肽的方法。最常用的两种酶是γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)和谷氨酰胺酶(glutaminase)。GGT属于转移酶,它能诱导γ-谷氨酰基的转移反应和谷氨酰胺的水解反应,使γ-谷氨酰基与不同的氨基酸结合生成不同的γ-谷氨酰肽,且反应不需要消耗ATP。早在2009年,Toelstede等[50]研究发现,对蓝色脉纹奶酪具有浓厚味贡献的一组γ-谷氨酰二肽是由青霉菌(Penicillium roquefortii)中的GGT参与合成的。同样地,Hillmann等[51]利用GGT活性检测和同位素标记法证实了帕玛森乳酪成熟过程中的浓厚味γ-谷氨酰二肽是由牛奶原料中的GGT催化产生的。另一项研究也发现,将GGT添加到日本发酵豆酱中能显著提高γ-Glu-Val和γ-Glu-Val-Gly的浓度,并使豆酱的鲜味和浓厚味得到提升[52]。另一种谷氨酰胺酶同样具有合成γ-谷氨酰肽的能力。Yang等研究发现,来源于淀粉芽孢杆菌的谷氨酰胺酶可以催化合成几种γ-谷氨酰肽(γ-[Glu](n≤5)-Phe/Val/Met),且这些短肽都具有良好的浓厚味活性[36-37,53]。此外,Suzukit等[54]同样证明了淀粉芽孢杆菌中的谷氨酰胺酶可以显著增加大豆蛋白和谷蛋白水解产物的浓厚味感。简言之,利用生物酶的催化特性生产kokumi肽,能够克服化学合成法的产率低、成本高和毒副作用的缺点,为kokumi肽的食用调味品生产提供良好的发展前景。

3.3 微生物发酵法

微生物发酵法是利用特定微生物代谢活动产生的多种酶类,使大分子蛋白质降解生成小分子肽段的方法。最为典型具有浓厚味活性的GSH是仅有的利用酵母菌发酵实现产业化生产的γ-谷氨酰肽[55-56]。但是利用微生物发酵法生产其他浓厚味活性的γ-谷氨酰肽仍处于初步阶段。Zhao等[35]研究发现,在面团发酵过程中添加罗伊氏乳杆菌能显著增加6种γ-谷氨酰二肽的含量,且当添加不同的罗伊氏乳杆菌株时,其发酵液中的γ-谷氨酰二肽含量也会产生差异。此外,许多研究证实了γ-Glu-Val-Gly的形成与多种微生物有关。Kuroda等[26]推断鱼酱中γ-Glu-Val-Gly的形成可能与芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、盐杆菌(Halobacterium)、弧杆菌(Vibrionaceae)和棒状杆菌(Corynebacterium)等的代谢活动有关。Sofyanovich团队[58]的研究发现,γ-Glu-Val-Gly是酿酒酵母生理反应的重要产物。另一项研究利用主成分分析同样地证实了γ-Glu-Val-Gly的形成与嗜盐四联球菌属(Tetragenococcusspp.)和芽孢杆菌属(Lentibacillusspp.)呈显著的正相关关系[30]。由此可见,具有浓厚味活性的γ-谷氨酰肽的形成与多种微生物有关,利用微生物发酵法生产γ-谷氨酰肽同样具有良好的前景,但是微生物发酵法所得到的γ-谷氨酰肽组成一般较为复杂,无法获得单一的目标γ-谷氨酰肽,分离纯化微生物发酵产物中具有浓厚味活性的γ-谷氨酰肽是实现产业化生产亟需攻克的难题。

4 结语

随着人们生活水平的提高,对食品的风味和质量有了新的追求,越来越趋向于“低盐、低糖、低脂”的健康饮食方式。Kokumi肽是继鲜味肽之后的一种新型食品调味剂,具有增强食品浓厚味感、延长回味、提升食品整体协调性和丰富度的特点,并且味觉阈值低,少量添加便能增加其他基本味感,能够有效地减少盐和糖等食品调味剂的使用量,符合人们追求食品天然属性的心理需求。但是,目前我国对kokumi肽的研究开发仍处于初步阶段,且停留在实验室的分离鉴定和kokumi肽与其它味感物质的复合应用研究上,对kokumi肽的制备技术尚未成熟,未能利用现有的生物工程技术实现kokumi肽的产业化生产。因此,如何科学地利用酶和微生物生产kokumi肽,提高产物的获得率和稳定性,以及进一步加强kokumi的味感特性和呈味机制的研究,并有目的地合成、改造或设计kokumi肽,对于丰富调味品种类,推动kokumi肽实现产业化生产和调味品行业的健康发展具有重要意义。