不同储藏温度对超巴氏奶货架期理化指标及风味的影响

依胜男,张书文,芦 晶,逄晓阳,宋慧敏,梁佳祺,郝莉雨,胡 诚,许晓曦,*,吕加平,*

(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030; 2.中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193)

液态奶根据其杀菌方式的不同,一般包括巴氏杀菌奶、超巴氏杀菌奶以及超高温瞬时灭菌奶(UHT)。目前常用巴氏杀菌奶热处理条件为72～75 ℃、15～20 s或80～85 ℃、10～15 s[1]。UHT处理条件是超过135 ℃并高于1 s,我国通常使用的UHT的处理方式为137 ℃、4 s。巴氏杀菌乳在杀死所有致病菌的基础上尽量减少了牛乳中营养物质的损失,在冷藏条件下可以保存1～2周[2]。UHT破坏了其中生长的全部微生物以及芽孢,其保质期可达常温保存45～180 d。巴氏杀菌奶与原料奶风味相似,尽可能保留了奶中的营养物质,但存在货架期较短的缺点。UHT虽保证了货架期,但由于热处理强度较大,奶中的活性营养物质被破坏,蛋白变性以及生成多种副产物等[3-4]。超巴氏杀菌处理条件为120～125 ℃、4～20 s不等[5],存在营养物质较超高温瞬时灭菌奶破坏少、货架期较巴氏杀菌奶长等优点[6]。

除热处理条件影响液态奶的品质外,储藏条件对于液态奶的品质也有很大的影响。液态奶在贮存期中会出现脂肪分离,蛋白质沉淀和胶凝以及风味变化等问题[6]。王欣[7]研究发现,随保藏时间的延长以及保藏温度的提高,UHT乳中蛋白质、乳脂肪等理化指标及感官品质均降低。Malmgren等[8]评价UHT乳在5、22、30、40 ℃下储藏六个月后的物理稳定性,结果显示所有温度下UHT乳出现不同程度的颗粒聚集和蛋白质下沉现象。Anne等[9]研究了储藏在10、20、30、40以及50 ℃三个温度下24周内UHT奶品质的变化,结果显示储藏温度低于30 ℃时在第24周时色泽发生明显变化,而在储藏温度高于40 ℃时,第六周色泽就发生明显变化。可见,国内外对UHT乳的货架期研究较深入,数据全面。但是,由于巴氏杀菌奶货架期较短,无法准确探究其货架期的品质变化,研究数据较少。同样,有关超巴氏奶货架期的品质变化数据较少,需要进一步全面深入的探讨研究。

本实验以生鲜奶为原料,超巴氏杀菌后的液态奶置于不同储藏温度下定期检测,研究在储藏过程中理化指标的变化以及储藏温度对各指标的影响。旨在分析超巴氏奶储藏期间品质的变化及初步探讨变化的原因,为产品储藏条件的选择以及货架期模型的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料乳 北京市三元绿荷牧场;偶氮酪蛋白、对硝基苯酚棕榈酸酯、对硝基苯酚 Sigma公司;磷酸盐缓冲液、三氯乙酸、Tris-HCl、DMSO 国药集团。

APV均质机、日本POWERPOINT杀菌机、沃迪无菌填充室的中式生产设备 上海沃迪科技有限公司;Zetasizer Nano ZS纳米粒径电位分析仪 英国马尔文仪器公司;Minolta CR-400色差仪 日本柯尼卡美能达公司;Model 680酶标仪 American,Bio-Rad;PEN3.5电子鼻 德国AIRSENSE公司;AsrreeⅡ/LS16电子舌 法国Alpha MOS公司;DELTA 320精密pH计 瑞士梅特勒-托利多股份有限公司;3K15离心机 德国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的准备 原料奶采用UHT中试设备对优质原料乳进行热处理。首先将牛乳预热到60～65 ℃,随后进行二级均质(20±2 MPa),再进入UHT中试设备进行120±1 ℃,15 s的热处理,最后进行无菌灌装。将样品储藏在4、25、37 ℃温度下进行货架期实验(2019.10.10)。

1.2.2 pH的测定 取100 mL样品,放入转子后在磁力搅拌器上混合均匀,插入pH计进行测量,在数值稳定后记录pH。

1.2.3 细菌蛋白酶活性的测定

1.2.3.1 样品蛋白酶活的测定 采用偶氮酪蛋白法[10],取1 mL牛乳与2 mL、0.5%的偶氮酪蛋白以及1 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲液充分混合后在37 ℃下反应2 h。反应结束后加入4 mL、5%的三氯乙酸终止反应。室温下静置30 min后,9500 r/min离心5 min,过滤后于345 nm处测吸光值。依据发光生成物生成的浓度不同,在345 nm处测定其吸光度值来定量酶的活性。

1.2.3.2 蛋白酶活性的定义 在345 nm下,每小时增加0.01个吸光值为一个酶活力单位。

1.2.4 脂肪酶活性的测定

1.2.4.1 样品脂肪酶活的测定 参照了Bendicho等[11]建立的方法,并做了适当的修改,具体的操作步骤如下:取100 μL超巴氏奶与500 μL Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L,pH9.0)混合,然后加入100 μL底物溶液(1 mmol/L 对硝基苯酚棕榈酸酯的DMSO溶液);充分混合后,45 ℃下孵育20 min;取200 μL溶液加入96孔酶标板中,在405 nm波长下测量吸光值。

1.2.4.2 标准曲线的制作 以50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)作为溶剂,分别配制浓度为0、50、100、150、200、250、300 μmol/L对硝基苯酚溶液,取200 μL不同对硝基苯酚溶液于96孔酶标板中,测量405 nm波长下的吸光值A405。

1.2.4.3 脂肪酶活性的定义 单位时间内水解对硝基苯酚棕榈酸酯释放1 μmol对硝基苯酚的酶活性定义为一个酶活单位U。

1.2.5 色差的测定 在稳定的标准光源D65环境下来测定液态奶色泽的变化。取20 mL牛乳于一次性培养皿中,利用色差仪对表征牛乳样品的色泽的L*、a*、b*值进行测定,每个样品测定3次,取算术平均值。色差仪通过三个指标反映样品的颜色差异,其中L*是指样品的明度,即黑白度,0为黑,100为白;a*是红绿值,>0为红,<0为绿,=0为中性色;b*是黄蓝值,>0为黄,<0为蓝,=0为中性色。

1.2.6 酪蛋白胶体粒径和Zeta电位的测定 室温下将牛乳样品与去离子水按照1∶1000稀释,然后过0.45 μm微滤膜处理,利用Zetasizer Nano ZS纳米粒径电位分析仪对牛乳的酪蛋白胶体粒径和Zeta电位进行测定,样品池均选用DTS1060弯曲式毛细管样品池。每个样品平行测定3次,取算数平均值。

1.2.7 电子鼻的测定 取1 mL样品放置于电子鼻专用的玻璃瓶中,封盖后在室温下平衡30 min,用电子鼻进行测定。电子鼻采用顶空进样方式,每个样品重复4次,筛选结果理想的3个作为平行。载气为空气,速度为300 mL/min。顶空获取时间为60 s,延滞180 s,选取48～52 s较平稳的阶段进行信息采集,用仪器自带软件进行主成分分析(principal component analysis,PCA)。

1.2.8 电子舌的测定 样品在4500 r/min下离心20 min后,除去脂肪,吸取1 mL脱脂乳,用80 mL超纯水稀释,放在专用烧杯中,待测。样品与校准溶液(超纯水)交替检测,每个样品测定7次,选取较稳定的后4次测定数据进行分析。用仪器自带软件进行判别因子分析(discriminant function analysis,DFA)。

1.3 数据处理

各实验均重复进行3次以上。实验数据采用SPSS 8.5和Origin Pro 9.1软件进行统计处理与作图分析。

2 结果与分析

2.1 不同储藏时间超巴氏杀菌奶理化指标的变化

2.1.1 储藏期间超巴氏奶pH的变化 超巴氏奶储藏期间pH变化如图1所示,由图1可知,超巴氏奶pH在储藏期间随时间的延长呈下降的趋势,并随储藏温度的升高,变化趋势逐渐增大。超巴氏奶在储藏第25 d后,三个储藏温度下pH呈现不同的下降趋势,差异极显著(P<0.01)。在储藏温度为4 ℃时,超巴氏奶pH从6.65下降到6.58,变化幅度很小,而在储藏温度为37 ℃时,pH由6.65下降到6.38,变化程度明显高于其他两个储藏温度。这与Hussain[12]的研究结果趋势一致,其研究发现,半脱脂UHT在三个月的保藏期间,保藏温度为4 ℃时pH几乎维持不变,保藏温度为25、45 ℃呈现不同趋势的下降。此外,Gaucher等[13]研究发现,保藏在40 ℃条件下储藏6个月的UHT奶pH由6.69降至6.21。影响超巴氏奶储藏期间pH的因素有很多,如磷酸钙盐的沉淀、乳糖的降解或蛋白质以及脂肪的水解等。结合本文测得蛋白酶活以及脂肪酶活含量增加的结果,pH的降低可能由于蛋白质和脂肪的降解生成游离氨基酸和有机酸导致的。

图1 三个储藏温度下pH的变化Fig.1 Changes of pH at three storage temperatures

2.1.2 储藏期间超巴氏奶蛋白酶活性的变化 图2为测得不同储藏温度下细菌蛋白酶活随时间的变化。由图2可见,超巴氏奶储藏在4、25 ℃温度下,细菌蛋白酶活均呈现缓慢的上升,两个储藏温度下,酶活力数值相差不大,差异不显著(P>0.05)。但在储藏温度为37 ℃时,蛋白酶活力在第25 d后急剧上升,由最初的0.65 U/mL升至3.2 U/mL,与4和25 ℃蛋白酶活力差异极显著(P<0.01)。Ziyaina等[14]研究发现,巴氏奶储藏过程中蛋白酶活性随储藏温度的升高而增高,但是在7 ℃以下蛋白酶活性维持非常低的状态。此外,同样对于储藏在37 ℃的液态奶,本文测得的超巴氏奶储藏过程中酶活力达到的最高值低于Ziyaina测得的巴氏奶酶活力达到的最高值,但高于郭奇慧等[15]测得UHT储藏过程中达到的最高值。可见,热处理强度越低以及储藏温度越高,细菌蛋白酶活性越高。

图2 三个储藏温度下蛋白酶活性的变化Fig.2 Changes of protease activityat three storage temperatures

生鲜奶中测得的细菌蛋白酶酶活力值达到4.5 U/mL。细菌蛋白酶主要来自于荧光假单胞菌,超巴氏杀菌并不能使细菌蛋白酶全部失活,细菌蛋白酶可导致储藏期间超巴氏奶的陈化凝胶以及蛋白质水解[16-18]。此外,有研究发现,细菌蛋白酶也是导致液态奶在储藏期间发生乳清析出、pH降低、风味改变等现象的原因之一[19-21]。结合本文蛋白酶活检测,由于后期蛋白酶活力明显升高,超巴氏奶不宜储存在37 ℃温度下。

表1 三个储藏温度不同时间色度L*、a*及b*值Table 1 L*,a* and b* value of different time at three storage temperatures

2.1.3 储藏期间超巴氏奶脂肪酶活性的变化 图3为测得不同储藏温度下脂肪酶活性随时间的变化。由图3可见,储藏在4 ℃条件下超巴氏奶的脂肪酶活力在储藏期间较为稳定,仅略有增加。而储藏在25、37 ℃条件下的超巴氏奶在储藏第10 d脂肪酶活性大幅增加,在10～45 d 脂肪酶一直保持较高活力,三个储藏温度下脂肪酶活力差异显著(P<0.05)。研究发现,脂肪酶具有极高耐热性,甚至在UHT处理后仍可残存活性[22]。实验测得生鲜奶中脂肪酶活性为12.8 U/mL。此外,刘晶等[23]研究发现,嗜冷菌分泌的脂肪酶最适活性温度为25～37 ℃。因此,储藏在25和37 ℃的超巴氏奶可能由于其在最适活性温度范围内,造成第10 d后脂肪酶活性迅速升高。

图3 三个储藏温度下脂肪酶活性的变化Fig.3 Changes of lipase activity at three storage temperatures

脂肪酶会导致超巴氏奶在储藏过程中发生牛乳酸化、脂肪上浮、脂肪酸氧化产生不良风味[24-26]。此外,非常少量的脂肪酶就可导致产品在储藏期间的感官缺陷。因此,尽量减少脂肪酶对超巴氏奶储藏期间的影响,应将其储藏在4 ℃的条件下。

2.1.4 储藏期间超巴氏奶色泽的变化 表1分别是不同储藏温度不同时间色泽L*、a*和b*的值。由表1可以看出,4 ℃储藏条件下L*值缓慢下降,不同储藏时间a*值和b*值差异不显著(P>0.05),只存在白度上的变化。当保藏温度为25和37 ℃时,L*值均呈现下降的趋势,a*值初始平缓后期缓慢上升,b*值在储藏期间急剧上升。三个储藏温度下,L*值在不同储藏时间差异显著(P<0.05),a*值和b*值在储藏第25 d三个储藏温度下差异极显著(P<0.05)。颜色的变化主要由于奶在保藏过程中蛋白质和乳糖会继续发生美拉德反应,进而产生糠氨酸、羟甲基糠醛以及类黑精等其他褐色物质,影响样品的色泽[27-28]。所以,L*值逐渐降低和b*值的逐渐加大与美拉德反应有关。L*值逐渐降低说明颜色越来越暗,b*值逐渐增高说明奶的颜色越来越偏向黄褐色。超巴氏奶分别储藏在4、25、37 ℃时,L*值分别由59.57降低到57.78、56.58和55.21。储藏在37 ℃条件下的超巴氏奶,b*值上升速度明显高于25 ℃储藏的超巴氏奶。说明随着储藏温度的升高,美拉德反应的速率逐渐增加,色泽变化越大。这与O’Connell等[29]的研究一致,其发现UHT奶储藏在任何温度下都会发生美拉德反应,但在高储藏温度下会优先发生。可见,储藏在4 ℃条件下的超巴氏奶颜色变化程度明显低于25和37 ℃。

图4 三个储藏温度下粒径的变化趋势Fig.4 Change trend of particle sizeat three storage temperatures

2.1.5 储藏期间超巴氏奶粒径以及Zeta电位的变化 图4为保藏期内粒径随时间的变化趋势。初始测得超巴氏奶粒径为180 nm,较Gaucher等[30]测得的UHT的粒径270 nm小。由于随着热处理强度的增加,乳清蛋白发生变性及其与酪蛋白胶束的结合导致酪蛋白胶束的大小增加[31]。由图4可知,三个储藏温度下前25 d粒径变化不大,差异不显著(P>0.05)。储藏在25和37 ℃的超巴氏奶在第25 d后粒径大幅度增加,在储藏第45 d粒径分别达到320和358 nm。储藏在4 ℃的超巴氏奶粒径在第35 d后稍微增加。第25 d后,三个储藏温度下粒径差异极显著(P<0.01)。可见,随着储藏温度的增加,粒径增加幅度越大。保藏后期粒径急剧增加可能由于细菌蛋白酶的作用导致超巴氏奶的凝胶化明显,部分粒子聚集形成颗粒,导致超巴氏奶粒径急剧增加。此外,可能由于储藏期间pH的下降导致蛋白质中磷酸钙的溶解,并从酪蛋白中解离出来,解离出的钙离子可与蛋白质络合形成“钙桥”,促进酪蛋白随后的聚集,导致粒径的增加[32]。

Zeta电位的大小是衡量胶体粒子稳定性的重要参数,绝对值较高意味着稳定性越高[33]。超巴氏奶储藏期间Zeta电位变化如图5所示,由图5可知,样品在4 ℃储藏时,电位变化幅度较小,储藏在25和37 ℃的样品,粒子所带负电荷量均先增加后减少。样品在25 ℃储藏35 d、37 ℃储藏25 d时,粒子所带负电荷分别最多。储藏初期Zeta负电荷的增加可能存在两个原因:第一在美拉德反应的第一阶段,乳糖与带正电荷的赖氨酸和精氨酸残基反应,正电荷的减少导致负电荷的增多[34]。其次,结合脂肪酶活力在储藏第10 d增加的现象推断,脂肪被脂肪酶氧化生成小分子有机酸分布在粒子表面,是以COO-的形式存在于粒子表面,从而导致负电荷增加[35]。粒子负电荷在储藏后期的减少可能由于粒子粒径变大,电位绝对值降低,稳定性降低的主要原因是由于酶的作用导致粒子大小发生变化,并且溶液的pH降低,从而导致体系电位的不稳定。

图5 三个储藏温度下Zeta电位的变化Fig.5 Change trend of zeta potentialat three storage temperatures

由粒径和Zeta电位可以看出,储藏在4 ℃条件下的超巴氏奶货架期内的品质改变明显低于储藏在25和37 ℃条件下的超巴氏奶。

2.2 不同储藏温度超巴氏奶风味的变化

2.2.1 电子鼻分析超巴氏奶货架期风味变化 使用电子鼻对3个不同储藏温度5个时间点检测的风味参数进行主成分分析,结果如图6所示。PC1和PC2贡献率和为99.88%,大于90%,说明两个主成分已经代表了主要信息特征。并且,PC1的贡献率高达98.12%。从图6中可以看出,4 ℃保藏温度下风味变化主要在第二主成分轴上,但主成分二贡献率仅1.76%,可见在4 ℃保藏期间超巴氏奶风味变化并不大。而在25和37 ℃保藏温度下风味变化主要在第一主成分轴上,可见在这两个保藏温度下风味变化差异明显,随着储藏时间的增加,可见主成分一占比在逐渐增加。此外,不同保藏条件不同期间超巴氏奶均与未保藏超巴氏奶差异明显。可见,储藏在4 ℃条件下的超巴氏奶在储藏期间风味变化小,而另外两个储藏温度下的超巴氏奶储藏期间风味变化较大。

图6 4、25以及37 ℃三个储藏温度下不同时间电子鼻PCA分析图Fig.6 PCA analysis of electronic nose at threestorage temperatures of 4,25 and 37 ℃注:每个样品均以C-储藏温度-储藏d数标注,其中C代表超巴氏奶。图7同。

2.2.2 电子舌分析超巴氏奶货架期风味变化 图7为超巴氏灭菌乳在不同保藏温度和时间条件下电子舌的分析结果,从图7中可以看出样品第一判别因子贡献率为98.47%,能反映出样品的整体特征信息。图中所有样品被分为两部分,其中未保藏样品、4 ℃保藏的全部样品以及在25 ℃条件下保藏10 d的样品分布于图的左侧,而其余样品分布于图的右侧。部分25 ℃和全部37 ℃保藏的样品与未保藏样品间距离较远,即滋味差异较大,左侧样品与未保藏样品间差异较小,虽然25 ℃保藏10 d的样品也居于左侧,但保藏时间只有10 d,基于保质期的考虑,也为了保证产品的风味,建议超巴氏灭菌乳在4 ℃环境下保藏。

图7 4、25以及37 ℃三个储藏温度下不同时间电子舌DFA分析图Fig.7 DFA analysis of electronic tongueat three storage temperatures of 4,25 and 37 ℃

3 结论

本文研究了超巴氏奶在不同温度下储藏45 d内理化指标及风味的变化。实验结果表明,4 ℃保藏条件下超巴氏奶细菌蛋白酶活以及脂肪酶活变化不明显,蛋白酶活在保藏温度37 ℃变化明显,在保藏第25 d后急剧上升。25和37 ℃保藏温度下的脂肪酶活性均在储藏第10 d后急剧上升,并维持在较高活力。此外,在储藏过程中,超巴氏奶pH下降、粒径增加、Zeta电位先下降后上升,并随储藏温度的增加,变化加快。对于色泽,4 ℃保藏下超巴氏奶只在L*值上有明显变化,而在25以及37 ℃保藏温度下L*、a*以及b*值均有明显变化。电子鼻和电子舌结果表明,储藏在4 ℃条件下的超巴氏奶气味和滋味储藏期间变化均不大,而储藏在37 ℃条件下的超巴氏奶风味变化明显。可见,超巴氏奶在4 ℃保藏条件下货架期可达45 d,若较高温度的保藏条件,储藏时间适当降低。