三七、黄芪总皂苷联合骨髓干细胞移植对糖尿病溃疡miRNA-146a的影响

杜玉青 刘亚莉 李友山 刘凤桐 黄天一

摘要 目的：探讨三七总皂苷（PNS）、黄芪总皂苷（TSA）联合自体骨髓干细胞治疗糖尿病溃疡对miRNA-146a的影响。方法：选取SD大鼠60只，在双足背上制成糖尿病足模型，采用全骨髓培养加贴壁法分离、扩增至第4代的骨髓间充质干细胞，按随机数字法将大鼠分为空白组、对照组、干细胞组、黄芪组;三七组干细胞组、黄芪组、三七组创面每日注射自体骨髓干细胞（0.3 mL/cm2），黄芪组每日加注黄芪注射液（0.3 mL/cm2），三七组每日加注血塞通（0.4 mL/cm2），7 d后处死，采用PCR法检测miRNA-146a水平，Western blot法检测TLR4 miRNA、NOD1 miRNA、核因子-κB miRNA的表达。结果：与对照组比较，干细胞组、黄芪组和三七组大鼠创面愈合率极显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）;与对照组比较，干细胞组、黄芪组和三七组大鼠miRNA-146a、TLR4 miRNA、核因子-κB miRNA、NOD1 miRNA表达量显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）;与干细胞组比较，三七组miRNA-146a、TLR4 miRNA、核因子-κB miRNA、NOD1 miRNA表达量显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：三七总皂苷、黄芪总皂苷联合骨髓干细胞治疗糖尿病足溃疡有效，其愈合机制可能与TLR4/核因子-κB通路上调miRNA-146a的表達有关。

关键词 三七;黄芪;大鼠;糖尿病溃疡;自体骨髓干细胞移植

Abstract Objective：To explore the mechanism of panax notoginseng saponins，total saponins of Astragalus combined with autologous bone marrow stem cell transplantation for treating diabetic ulcer on mirna-146a.Methods：A total of 60 SD rats were selected to make diabetic foot model on the dorsum of both feet.The fourth generation of bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and expanded by whole bone marrow culture and adherent method.According random number table method，the rats were randomly divided into a blank group，a control group，a stem cell group，and Radix Astragali seu Hedysar group.The wounds of Radix Notoginseng，stem cell group，Radix Astragali seu Hedysar group were injected with autologous bone marrow stem cells（0.3 mL/CM2）every day，Radix Astragali seu Hedysar group was injected with astragalus injection（0.3 mL/CM2）every day，and Radix Notoginseng group was injected with Xuesaitong（0.4 mL/CM2）every day.After 7 days，they were sacrificed.The content of miRNA-146a was detected by PCR.The expression of TLR4 miRNA，NOD1 miRNA，and NF-κB miRNA was detected by Western blot.Results：Compared with the control group，the wound healing rate of rats in stem cell group，Radix Astragali seu Hedysar group and Radix Notoginseng group increased significantly（P<0.01），and the expression of miRNA-146a，TLR4 miRNA，NF-κ B miRNA and NOD1 miRNA in stem cell group，Radix Astragali seu Hedysari group and Radix Notoginseng group increased significantly compared with the control group（P<0.05）.Compared with stem cell group，the expression of miRNA-146a，TLR4 miRNA，NF-κ B miRNA and NOD1 miRNA in Radix Notoginseng group was significantly increased（P<0.05）.Conclusion：Panax notoginseng saponins and astragalus saponins combined with bone marrow stem cells are effective in the treatment of diabetic foot ulcer，and the healing mechanism may be related to the up-regulation of miRNA-146a expression by TLR4/NF-κ B pathway.

Keywords Radix Notoginseng; Radix Astragali seu Hedysari; Rats; Diabetic ulcer; Autologous bone marrow stem cell transplantation

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.010

糖尿病足（Diabetic Foot，DF）是糖尿病的严重并发症。据统计，截肢患者每年约50%是由于糖尿病引起的，其中糖尿病患者发生的原因是足部溃疡加重引发溃疡面大面积感染以及坏疽[1-2]。糖尿病足在中医学中属于“脱疽”“消渴”范畴，多因病情缠绵难愈，伤津耗气，气虚则无力行血，久病脉络瘀阻，发生脱疽，患病人群主要是中老年人，气血渐弱，以气虚血瘀证型多见[3]。有研究表明，黄芪总皂苷（Total Saponins of Astragalus，TSA）能抑制胰脂肪酶活性和醛糖还原酶活性，减少糖尿病的诱发因素，延缓糖尿病并发症的病程[4]。另外，三七总皂苷（Panax Notoginseng Saponins，PNS）通过抑制转化生长因子（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）抗氧化，加速细胞凋亡，其Caspase-3基因转录上调，减轻糖尿病肾病足细胞损害[5]。目前，利用現代生物工程技术-自体骨髓干细胞（Bone Marrow Stem Cell，BMSC）移植在临床上治疗糖尿病足掀起热潮[6]，其主要成分是造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）和骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSC），在缺血环境中生成平滑肌细胞和内皮细胞（Endothelial Cels，ECs）并增殖，在局部组织生成许多微细血管，重建细胞外基质，改善缺血、缺氧的下肢状态[7]。研究发现，miRNA（microRNA）可以调控骨髓干细胞内miRNA的水平，可有效改善干细胞移植的治疗效果，针对细胞分化、移植后干细胞的生存能力、血管新生及细胞凋亡等方面有着积极的作用[8]。但如何通过骨髓干细胞分化和调控促进糖尿病足溃疡愈合的机制尚不明确。本课题旨在探究中药三七、黄芪外治干预大鼠自体骨髓干细胞治疗糖尿病溃疡过程中，如何调控miRNA水平促进糖尿病足溃疡愈合的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 8周龄SPF级SD大鼠，雄性，体质量80～100 g，购自中国医学科学院动物所，合格证号SCXK（京）2016-0001。所有动物实验研究均符合中国中医科学院动物伦理委员会有关动物研究指导原则。动物饲养条件：在三级动物室无菌饲料喂养，每5只1笼，温度（25±2）℃，相对湿度（55±5）%，12 h光照昼夜循环，自由获取食物和水。

1.1.2 药物 黄芪注射液（神威药业集团有限公司，国药准字Z13020999），血塞通注射液（广西梧州制药股份有限公司，国药准字Z20025652）。

1.1.3 试剂与仪器

试剂：MEM/F12干粉培养基（Gibco Invitrogen Corporation）（Sigma公司，美国，批号：1322013），链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）（Sigma公司，美国，批号：3444091），血糖试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：7603061），磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）（北京百奥莱博科技有限公司，批号：3342213），椎虫蓝（上海生工公司，批号：8713518），SV总RNA分离试剂盒（Promega公司，美国，批号：2273041），反转录试剂盒（Promega公司，美国，批号：3357123），SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂盒（ABI公司，美国，批号：KS14679），TLR4（Santa Cruz公司，美国，批号：0284381），NOD1受体（Santa Cruz公司，美国，批号：55556231），核因子-κB（Santa Cruz公司，美国，批号：4439720），ki67的抗体试剂盒（Santa Cruz公司，美国，批号：3802342）。相关引物序列由北京优博兰基因技术有限公司合成。见表1。

仪器：荧光倒置相差显微镜（尼康公司，日本，型号：Ti-E/U/S），多功能酶标仪（BioTek公司，美国，型号：bio-tek ELX800），生化自动分析仪检测（Beckman公司，美国，型号：Dxc 800），PCR仪（Applied Biosystems公司，美国，型号：7500 Real-time），图像分析系统（Molecular Devices公司，美国，型号：MetaMorph）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

糖尿病足大鼠模型：经高脂饲料（配方：蛋黄2.5%，蔗糖20%，猪油10%，基础饲料67.5%）饲养1个月，体质量控制在300～350 g，进行腹腔40 mg/kg注射STZ。观察1周，取成模稳定的糖尿病大鼠，在大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛1 mL/100 g进行麻醉，用电动剃须刀除去大鼠背部长毛，面积约4 cm×4 cm，在脱毛区用直径为3 cm的圆形塑料盖蘸龙胆紫标记造模面积，在无菌条件下剪去造模区皮肤，深达筋膜。六层医用纱布覆盖创面，用医用纸胶带包扎固定。优选60只健康成模的糖尿病溃疡大鼠及15只空白对照溃疡大鼠供实验使用。空白对照组溃疡大鼠15只（简称空白组）;对照组糖尿病溃疡大鼠15只（简称：对照组）;单纯干细胞组糖尿病溃疡大鼠15只（简称：干细胞组）干细胞+黄芪组糖尿病溃疡大鼠15只（简称黄芪组）干细胞+三七组糖尿病溃疡大鼠15只（简称三七组）[10]。

自体骨髓干细胞的分离、培养、标记：从SD大鼠股骨提取骨髓细胞，采用全骨髓培养加贴壁选择法对骨髓间充质干细胞分离、扩增，对第4代的骨髓间充质干细胞进行BrdU标记，标记终浓度为10 mg/L，标记时间24 h[11];然后收集培养细胞，采用椎虫蓝拒染活细胞计数法计数活细胞数;并且取一滴悬液制作爬片。最终计数细胞时采用血细胞计数板，按照分组应用PBS缓冲细胞。

1.2.2 给药方法 空白对照组、对照组大鼠创面不予处理，干细胞组创面注射一次自体骨髓干细胞（0.3 mL/cm2）[12]，每日清洁换药1次，以小纱布（4 cm×4 cm）覆盖，医用纸胶带包扎固定;黄芪组创面注射一次自体骨髓干细胞（0.5 mL/cm2），每日创面内注射黄芪注射液0.3 mL/cm2[13]，以小纱布（4 cm×4 cm）覆盖，医用纸胶带包扎固定;三七组创面注射1次自体骨髓干细胞（0.5 mL/cm2），每日创面内注射血塞通注射液0.4 mL/cm2[14]，以小纱布（4 cm×4 cm）覆盖，医用纸胶带包扎固定。7 d后将大鼠麻醉（3.5%水合氯醛1 mL/100 g），腹主动脉取血（量约8 mL）处死[15]。同时创面中心点肉芽组织2份（各5 g左右），立即冷冻于液氮中保存，用于实时荧光定量PCR法和Western blot检测。

1.2.3 检测指标与方法

观察一般情况：观察并记录SD大鼠情况，尤其是大鼠每日的体质量数值改变。

创面愈合情况：记录每日创面愈合面积，计算创面愈合率，创面愈合率=（给药前创面面积-未愈合创面面积）/给药前创面面积×100%。

荧光定量PCR法：取冰冻创面组织块称重后剪碎，使用一步法提取RNA，通过实时荧光定量PCR法检测组织中miRNA-146a水平。实验结束后，收集血管组织，SV总RNA分离试剂盒提取组织的总RNA，用反转录试剂盒进行逆转录，SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR试剂盒扩增，用相对定量表达法进行结果的定量分析。

Western blot法：收集血管组织，MBST裂解液裂解组织和抽提组织总蛋白，用Bradford法测定蛋白浓度，调蛋白浓度使各组一致。等量样品上样，SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳，然后将蛋白电转移至PVDF上电泳，依次用一抗和二抗，加入增强化学发光试剂后用感光胶片曝光。用图像分析系统对Western blot结果进行灰度扫描，以对照组的面积灰度值为1.0与实验组进行比较和定量分析。检测皮肤组织中TLR4 miRNA，NOD1 miRNA和核因子-κB miRNA表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示。符合正态分布的数据采用单因素方差分析，方差齐的数据两两比较采用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量 与空白组比较，糖尿病大鼠体质量显著减小，差异有统计学意义（P<0.05）;与对照组比较，三七组、黄芪组大鼠体质量显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）;与干细胞组比较，三七组大鼠体质量极显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.2 创面愈合率 与空白组比较，糖尿病大鼠创面愈合率显著减小，差异有统计学意义（P<0.05）;与对照组比较，干细胞组、黄芪组和三七组大鼠创面愈合率极显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）;與干细胞组比较，三七组大鼠创面愈合率显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.3 实时荧光定量PCR检测皮肤组织中miRNA-146a表达 与空白组比较，糖尿病大鼠miRNA-146a表达量显著减小，差异有统计学意义（P<0.05）;与对照组比较，干细胞组、黄芪组和三七组大鼠皮肤组织miRNA-146a表达量显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）;与干细胞组比较，三七组大鼠皮肤组织miRNA-146a表达量显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

2.4 Western blot法检测皮肤组织中TLR4 miRNA，NOD1 miRNA和核因子-κB miRNA表达

2.4.1 皮肤组织中TLR4 miRNA表达 与空白组比较，糖尿病大鼠TLR4 miRNA表达量显著减小，差异有统计学意义（P<0.05）;与对照组比较，干细胞组、黄芪组和三七组大鼠皮肤组织TLR4 miRNA表达量显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）;与干细胞组比较，三七组大鼠皮肤组织TLR4 miRNA表达量显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1，表5。

2.4.2 Western blot法检测皮肤组织NOD1 miRNA表达 与空白组比较，糖尿病大鼠NOD1 miRNA表达量显著减小，差异有统计学意义（P<0.05）;与对照组比较，干细胞组、黄芪组和三七组大鼠皮肤组织NOD1 miRNA表达量显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）;与干细胞组比较，三七组大鼠皮肤组织NOD1 miRNA表达量显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1，表6。

2.4.3 PCR和Western blot检测皮肤组织核因子-κB miRNA表达 与空白组比较，糖尿病大鼠核因子-κB miRNA表达量显著减小，差异有统计学意义（P<0.05）;与对照组比较，干细胞组、黄芪组和三七组大鼠皮肤组织核因子-κB miRNA表达量显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）;与干细胞组比较，黄芪组和三七组大鼠皮肤组织核因子-κB miRNA表达量显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1，表7。

3 讨论

溃疡创面愈合要通过新生肉芽组织、形成新血管、胶原蛋白集聚、重建组织等过程。但是糖尿病足的溃疡面组织分化水平降低、血管形成速度缓慢等原因阻碍溃疡愈合，甚至日久不愈。干细胞能够分化、增殖细胞，在溃疡区分泌多种细胞因子，增强血管新生能力，改建微循环通路，促进创面修复。研究发现，MSC注射STZ的加强版糖尿病大鼠修复溃疡面的速度显著提高，其原因可能是骨髓干细胞能够在缺血的组织中增殖、分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞，在溃疡组织中满足创面愈合的血管量，增强局部溃疡面的细胞营养以及促进坏死组织的排泄[16]。肖青青等[17]认为降低糖尿病足溃疡面miRNA水平，会引起溃疡的过度炎性反应发生，降低创面修复能力。

miRNA是在近些年来生物分子中探知的真核内源性RNA，是一类含有18～24 bp的非编码单链分子，主要发挥调控功能[18]。miRNA装载入RNA诱导沉默复合体（RNA Induced Silencing Complex，RISC）的单链miRNA经过自体局部互补（多和miRNA第2～8的Seed Sequence互补）和识别的靶分子miRNA，提高靶分子翻译能力和稳定能力，在很大程度上降低基因表达能力[19]。miRNA-146种类分为2种，分别是miRNA-146a（5号染色体），miRNA-146b（10号染色体），其作用基本相同，目前主要研究miRNA-146a[20]。李鸿飞[21]在体内敲掉老鼠的miRNA-146a，引起血管组织完全破裂，血管内皮细胞分化、参与血运的能力下降，甚至发生严重坏死，说明miRNA-146a的表达调节了内皮细胞增殖，迁移及参与血形成的能力。而Bhaumik等[22]研究表明，白细胞介素、脂多糖、肿瘤坏死因子等炎性反应递质等通过核因子-κB依赖途径上调miRNA表达，促进血管平滑肌增殖。Toll样受体（Toll-like Receptor，TLR）是新发现的一类天然免疫受体，对先天性免疫和获得性免疫有积极影响。Taganov等[23]发现TLRs能够诱导miRNA的表达，而TLR4是所有TLRs中唯一能够经分子传递信号的受体。而NOD样受体与TLRs相似，是一种新型功能胞质型固有免疫模式识别受体（PRR），最有代表性的是NODl和NOD2[24]。Franchi等[25]用NODl特异性配体刺激诱导的离体人脂肪细胞诱核因子-κB p65的核转导，炎性反应递质的产生显著增加。

本实验中，干细胞组miRNA-146a、TLR4 miRNA、核因子-κB miRNA表达量比对照组显著增大，推测miRNA-146a是通过TLR4/核因子-κB信号通路发挥作用的。TLR4通路的激活导致miRNA-146a表达，上调的miRNA-146a又可以活化TLR4信号通路中核因子-κB上游的2个靶基因IRAKl和TRAF6，发挥对TLR信号通路的负性调控作用，减少炎性反应的过度发生，促进骨髓干细胞增殖，改善微循环，加速创面愈合。NODl miRNA表达的增加可能是NODl miRNA刺激产生炎性反应递质，炎性递质经核因子-κB通路上调miRNA-146a，在TLR4通路的负调节下，改善创面的炎性反应。

药理研究表明，黄芪能促进小鼠外周血造血干细胞移植术后早期白细胞的重建[26]。而陈媛媛等[27]证实三七花总皂苷在吸收炎性物质、肉芽新生以及表皮形成等方面效用显著。程龙等[28]表明三七总皂苷能加速大脑合成分泌碱性成纤维细胞生长因子，诱导侧脑室外侧壁神经干细胞的分化生長。但三七、黄芪总皂苷较骨髓干细胞移植，为何更能促进糖尿病溃疡，其作用机制需要进一步研究。

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（2019-07-22收稿 责任编辑：杨觉雄）