附子理中汤对非酒精性脂肪性肝炎大鼠内毒素及其受体的影响

付勇刚 杨家耀

摘要 目的：探究附子理中湯对非酒精性脂肪性肝炎大鼠内毒素及其受体的影响。方法：将75只SD雄性大鼠随机分为3组，分别为正常组，模型组，附子理中汤观察组。采用腹主动脉取血法，收集血液后离心取上清，通过双抗体夹心法检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和鲎合成基质显色法检测内毒素表达水平;免疫组织化学法检测肝组织内CD14表达水平，并利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测Toll样受体-4（TLR-4）与TNF-α mRNA表达水平。结果：与正常组比较，模型组TNF-α水平显著提高，且在第12～24周内持续维持较高水平;附子理中汤观察组TNF-α水平较模型组显著降低，但仍高于正常组;正常组大鼠肝脏TNF-α mRNA未见其表达，模型组TLR4和TNF-α mRNA表达量均显著升高。与模型组比较，附子理中汤观察组TLR4和TNF-α mRNA显著低于模型组，但仍高于正常组TLR4和TNF-α mRNA表达;正常组只有少量细胞能够表达CD14。与正常组比较，模型组大鼠肝组织在第12～24周内，CD14表达的阳性细胞数持续升高，在24周时略有降低，而附子理中汤观察组CD14表达的阳性细胞数与模型组比较显著减少。结论：附子理中汤可降低非酒精性脂肪性肝炎大鼠内毒素及其受体表达。

关键词 附子理中汤;非酒精性脂肪性肝炎;内毒素;Toll样受体-4;肿瘤坏死因子-α;CD14;信使核糖核酸;逆转录-聚合酶链反应;双抗体夹心法;免疫组织化学法

Abstract Objective：To explore the effects of Fuzi Lizhong Decoction on endotoxin and its receptor in rats with nonalcoholic steatohepatitis.Methods：A total of 75 SD male rats were randomly divided into 3 groups：a normal group，a model group and a treatment group with Fuzi Lizhong Decoction.Abdominal aortic blood sampling method was used，blood was collected and centrifuged to take supernatant，and the expression level of endotoxin was detected by double antibody filling method to detect tumor necrosis factor alpha（TNF-α）and Limulus synthetic matrix color method was used to detect endotoxin expression; immunohistochemical method was used to detect the expression level of CD14 in liver tissues，and the reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）method was used to detect the expression levels of Toll-like receptor-4（TLR-4）and TNF-α mRNA.Results：Compared with the normal group，the level of TNF-α in the model group increased significantly，and continued to maintain a high level during the 12th to 24th weeks; the level of TNF-α in the Fuzi Lizhong Decoction was significantly lower than that in the model group，but it was still higher than that in the normal group.The expression of TNF-α mRNA in liver of normal group rats was not found，and the expression levels of TLR4 and TNF-α mRNA in model group were significantly increased.Compared with the model group，the TLR4 and TNF-α mRNA of the Fuzi Lizhong Decoction group were significantly lower than the model group，but it was still higher than TLR4 and TNF-α mRNA expression in the normal group; only a small number of cells in the normal group were able to express CD14.Compared with the normal group，the number of CD14-expressing positive cells in the model group′s liver tissue continued to increase from 12 to 24 weeks，and slightly decreased at 24 weeks，while the number of CD14-expressing positive cells in the Fuzi Lizhong Decoction group significantly reduced compared with the model group.Conclusion：Fuzi Lizhong Decoction can reduce the expression of endotoxin and its receptor in non-alcoholic steatohepatitis rats.

Keywords Fuzi Lizhong Decoction; Nonalcoholic steatohepatitis; Endotoxin; Toll-like receptor4; Tumor necrosis factor-α; CD14; Messenger RNA; Reverse transcription-polymerase chain reaction; Double antibody filling method; Immunohistochemical method

中圖分类号：R289.4文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.009

非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH）是指没有饮酒史，非肝炎病毒诱导的一类与酒精性脂肪肝炎具有相似的病理特征的一种疾病[1]。接近15%的非酒精性脂肪性肝炎可出现肝纤维化，10年病程的患者可发生肝硬化及肝衰竭，严重可致肝细胞癌[2]。非酒精性脂肪性肝炎的发病机制尽管尚未完全明确，但认为与脂质代谢紊乱、炎性反应及胰岛素抵抗紧密相关。研究显示非酒精性脂肪性肝炎患者均伴有不同程度的肠源性内毒素血症，内毒素穿透细胞肠壁屏障，与脂多糖结合蛋白（Lipopolysaccharide Binding Protein，LBP）结合后输送至肝脏，随之由库普弗（Kupffer）细胞清除[3-4]，同时肝脏固有免疫病原识别受体Kupffer细胞表面4型Toll样受体-4（Toll-like Receptor4，TLR-4）被激活，诱导肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）等炎性反应递质生成与释放，其中TNF-α结合TNF-α受体，可对肝细胞具有直接的毒性作用，可促使肝细胞坏死或凋亡，同时能趋化细胞内的中性粒细胞发生浸润释放自由基，诱导细胞损伤[5-7]。内毒素受体亚型中CD14的功能作用最突出。目前治疗非酒精性脂肪性肝炎尚无特效药，西药治疗非酒精性脂肪性肝炎多以保肝为主，且长期服药也存在不良反应。中医在非酒精性脂肪性肝炎通过辨证施治获得了良好的效果，附子理中汤来源于宋代陈言所著的《三因极一病证方论》，临床主要用于治疗存在炎性反应的胃溃疡[8]或慢性结肠炎[9]，我们将附子理中汤治疗非酒精性脂肪性肝炎获得了良好的效果，减轻重型肝炎患者的脾阳虚等现象，但治疗的机制尚不明确，且近年来有较多的机制研究显示中药治疗非酒精性脂肪性肝炎是与调控外周血或肝组织TLR4、TNF-α及CD14表达有关[10]。本研究通过研究附子理中汤对高脂诱导的非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织TLR4、TNF-αmRNA及CD14表达等相关指标的影响，探究附子理中汤对非酒精性脂肪性肝炎大鼠的可能机制。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

选取SD雄性大鼠，2月龄，200～220 g，购自北京动物医学院。实验时动物房保持12 h光照与黑暗交替，相对湿度60%左右，室温保持在22 ℃左右，各组大鼠均可自由饮水、采食。

1.1.2 药物

附子理中汤（人参10 g、白术15 g、干姜10 g、制附子10 g、炙甘草3 g），自制，加入5倍药材的纯净水，浸泡30 min，大火煮沸，40 min，加入生姜10 g，连续煎煮2次，合并煎液，浓缩至相当于10 g生药/mL，即得。

1.1.3 试剂与仪器

Toll样受体-4（Toll-like Receptor4，TLR-4）与TNF-α上下游引物由北京的天根有限公司合成;高脂饲料（2%胆固醇，10%猪油，普通饲料）（自制）;水合氯醛（化学纯，北京化工厂，批号：019663）;石蜡（化学纯，北京化工厂，批号：020016）、β-actin（南京建成生物工程研究所，货号：X1546）;显色基质鲎试剂盒（厦门市鲎试剂实验厂有限公司，货号：020106）;大鼠CD14免疫组织化学试剂盒、TNF-α和内毒素酶联免疫吸附试验法（ELISA）试剂盒均购自武汉的默沙克生物科技有限公司，货号为020117、019608、020152。c1000型PCR仪（Bio-rad公司，美国，货号：c1000）;Multiskan Sky全波长酶标仪（Thermo公司，美国，货号：51119570）;ME104E ME204E型万分之一电子天平（美国梅特勒-托利多集团，美国，货号：ME204）;VCM-3558型轮转式石蜡切片机（新乡市维克科教仪器有限公司，货号：VCM-3558）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

将75只SD雄性大鼠随机分为3组，分别为正常组，模型组，附子理中汤观察组。其中模型组和药物观察组喂食高脂饲料（2%胆固醇，10%猪油，普通饲料），正常组喂食普通饲料。

1.2.2 给药方法

附子理中汤观察组喂食高脂饲料的同时，每天定时灌胃附子理中汤。正常组，模型组每天定时灌胃生理盐水。

1.2.3 检测指标与方法

分别在第8、12、16周各取3只大鼠处死，24周后将其全部处死取材，并在大鼠处死前隔夜禁食。1）TNF-α和内毒素表达水平：使用10%水合氯醛将大鼠麻醉后，采用腹主动脉取血法获得2 mL全血，3 500 r/min，离心半径8 cm，4 ℃条件下离心15 min，转移上清液至新的离心管中，置于-80 ℃保存。TNF-α使用双抗体夹心法，内毒素检测采用鲎合成基质显色法进行检测。采用免疫组织化学法检测肝组织内CD14表达水平：10%水合氯醛将大鼠麻醉后，解剖其腹部，使肝组织暴露，剪取适当组织置于固定液中保存。固定2 h后进行脱水包埋，对包埋组织进行石蜡切片，随即常规脱蜡，通过抗原修复，抗体孵育后，进行常规脱水和透明，封片待用。根据视野下观察计数，读取其阳性细胞数。采用逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）检测Toll样受体-4（TLR-4）与TNFα mRNA表达水平：使用TRizol法进行肝组织RNA提取，提取后的RNA立即进行RNA反转录，获得CDNA。取适量CDNA，以β-actin为内参，对TLR4和TNFα基因进行扩增。根据设定参数进行引物扩增，扩增体系为：CDNA 7.5，加样缓冲液1.5倍，进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，并通过RT-PCR仪获得扩增情况，从而计算相关基因的mRNA相对表达量，引物及序列见表1。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件处理数据，计量资料用均数标准（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用SNK检验，多组间计量资料的比较采用方差分析，计算F值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 附子理中汤对非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清内TNF-α水平的影响

与正常组比较，模型组TNF-α水平显著提高，且在第12～24周内持续维持较高水平;附子理中汤观察组TNF-α水平较模型组显著降低，但仍高于正常组。见表2。

2.2 附子理中汤对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏内TLR4和TNF-α mRNA表达的影响

正常组大鼠肝脏TNF-α mRNA未见其表达，模型组TLR4和TNF-α mRNA表达量均显著升高。与模型组比较，附子理中汤观察组TLR4和TNF-α mRNA显著低于模型组，但仍高于正常组TLR4和TNF-α mRNA表达。见表3和图1。

2.3 附子理中汤对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏内毒素受体CD14的影响

正常组只有少量细胞能够表达CD14。与正常组比较，模型组大鼠肝组织在第12～24周内，CD14表达的阳性细胞数持续升高，在24周时略有降低，而附子理中汤观察组CD14表达的阳性细胞数与模型组比较显著减少。见表4。

3 讨论

附子理中汤为理中汤中加附子而成的用于温中祛寒的理想药方，且可增强小鼠耐寒、镇痛的作用，同时对脾寒胃虚患者具有较强的调节作用。而关于附子理中汤对非酒精性脂肪性肝炎患者影响的报道较为少见。因此，本研究附子理中汤对非酒精脂肪性肝炎大鼠体内CD14、TLR4、TNF-α和内毒素表达影响，探究附子理中汤对非酒精性脂肪性肝炎大鼠内毒素及其受体的作用。

本研究结果发现附子理中汤可显著降低非酒精性脂肪性肝炎大鼠体内TNF-α水平和CD14表达的阳性细胞数，同时可促使TLR4和TNF-α基因表达水平显著下调。内毒素在血循环中与受体蛋白结合形成复合物后，便与位于细胞膜上的CD14受体结合，在相关蛋白的协同作用下，TLR4信号受体将其传导至细胞，进而促进细胞内各种炎性反应递质被激活、释放。内毒素的肝毒性来源于库普细胞，其在肝脏内主要表达TLR4和CD14，當其在肝组织内表达发生波动可反映出内毒素受体表达升高[11]。已知脂质过氧化物和氧化应激是造成非酒精性脂肪性肝炎二次损伤的主要原因，而脂质氧化的参与递质内毒素在其中起着重要作用。CD14在主要位于库普弗细胞表面，内毒素可通过CD14促进库普弗细胞激活，进而促进炎性反应递质的分泌，如TNF-α[12]。TNF-α作为肝脏疾病发展过程中的一个关键控制因子，与肝损伤有着密切的关系。酒精性肝硬化患者体内的TNF-α和其受体-P75，-55表达均显著增加，且与其患病的严重程度有关[13]。而当将小鼠体内TNF-αR1被敲除后，发现乙醇引发的肝损伤较对照组显著减轻，且TNF-αR1是TNF-α的激活剂，证实TNF-α在酒精性脂肪性肝炎发病中具有重要作用。研究发现，TNF-α是非酒精性脂肪性肝炎发生发展的关键递质，ob/ob小鼠高脂喂养并给予抗-TNF-α抗体，实验4周后对肝组织具有明显的改善作用，且肝炎指标降低，IR和脂肪酸均减少[14]。因此，研究药物对非酒精性脂肪性肝炎内TNF-α表达的影响，有利于判断药物对非酒精性脂肪性肝炎的影响。

内毒素不但对肝细胞具有直接毒性，而且可与结合蛋白相结合，如CD14和TLR4受体结合后能促使库普弗细胞被激活后，促进核因子-κB等转录因子活化，进而促进各种化学因子和细胞因子转录合成、释放，诱导肝损伤[15]。据报道，TNF-α不仅可介导内毒素生物学效应，且可诱导多种递质的协同作用，进而促使内毒素的多种生物学效应被扩大，致使肝损害[16]。Bondeva等[17]发现，337例老年人中，约有21.5%患者患有内毒素血症，血清中的内毒素含量与体质量指数、三酰甘油水平正相关。研究发现，非酒精性脂肪性肝炎患者的小肠内细菌出现过度生长现象的同时，血清内TNF-α表达水平也伴随着升高[18]。在脂肪性肝炎的研究中发现，肝脏内出现CD14表达增强，血清内TNF-α表达上调等现象，间接表明非酒精性脂肪性肝炎与内毒素肝损伤具有相关性。

综上所述，附子理中汤可降低非酒精性脂肪性肝炎大鼠内毒素及其受体表达。

参考文献

[1]Suzuki A，Diehl AM.Nonalcoholic Steatohepatitis[J].Annu Rev Med，2017，68：85-98.

[2]Perumpail BJ，Khan MA，Yoo ER，et al.Clinical epidemiology and disease burden of nonalcoholic fatty liver disease[J].World J Gastroenterol，2017，23（47）：8263-8276.

[3]李楠，徐正婕，段晓燕，等.富含单不饱和脂肪酸饮食对非酒精性脂肪性肝炎大鼠胰岛素敏感性的影响[J].浙江医学，2017，39（11）：865-870.

[4]李富强，吴小翠，徐丽娜，等.烟碱型乙酰胆碱受体α7基因对非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝脏炎症反应的作用及其机制[J].中华肝脏病杂志，2016，24（10）：767-771.

[5]Abdel-Razik A，Mousa N，Shabana W，et al.Rifaximin in nonalcoholic fatty liver disease：hit multiple targets with a single shot[J].Eur J Gastroenterol Hepatol，2018，30（10）：1237-1246.

[6]Yang JM，Sun Y，Wang M，et al.Regulatory effect of a Chinese herbal medicine formula on non-alcoholic fatty liver disease[J].World J Gastroenterol，2019，25（34）：5105-5119.

[7]李楠，徐正婕，段晓燕，等.富含单不饱和脂肪酸饮食对非酒精性脂肪性肝炎大鼠胰岛素敏感性的影响[J].浙江医学，2017，39（11）：865-870.

[8]黄家望，谢希，陈平安，等.附子理中汤治疗胃溃疡的药效机制探讨[J].中医药学报，2019，47（6）：36-40.

[9]黄宁，龚金晖.温针灸合附子理中汤治疗慢性结肠炎疗效分析[J].中国继续医学教育，2020，12（1）：149-151.

[10]龚毅，范伟，张莹，等.银杏叶提取物对大鼠非酒精性脂肪肝炎肝脏保护作用的研究[J].重庆医学，2015，44（30）：4190-4192.

[11]冷静，田华捷，黄甫，等.BZL方对非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠肠黏膜损伤的保护作用[J].世界中医药，2019，14（3）：585-592.

[12]Lin SH，Chuang HY，Ho JC，et al.Treatment with TNF-α inhibitor rectifies M1 macrophage polarization from blood CD14+ monocytes in patients with psoriasis independent of STAT1 and IRF-1 activation[J].J Dermatol Sci，2018，91（3）：276-284.

[13]張雯，彭琼.乙肝肝硬化患者肠道菌群与肝功能及血清炎症因子水平的关系[J].现代消化及介入诊疗，2020，25（2）：158-162.

[14]张超，李昌平，聂娇.槲皮素对非酒精性脂肪肝模型大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶1和肝X受体α表达的影响[J].中国药理学与毒理学杂志，2017，31（8）：807-814.

[15]赵文霞，闫乐，邵明义，等.化痰祛湿活血方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠ADPN/AMPK/ACC通路的影响[J].临床肝胆病杂志，2017，33（5）：932-936.

[16]Chaouali M，Azaiez MB，Tezeghdenti A，et al.Association of TNF-α-308 Polymorphism with Susceptibility to Autoimmune Hepatitis in Tunisians[J].Biochem Genet，2018，56（6）：650-662.

[17]Bondeva T，Schindler C，Schindler K，et al.MORG1+/- mice are protected from histological renal damage and inflammation in a murine model of endotoxemia[J].BMC Nephrol，2018，19（1）：29.

[18]刘江，吴巍，顾栋桦，等.新生血管生成促进合并缺氧的非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝纤维化形成的研究[J].中华肝脏病杂志，2017，25（7）：517-522.

（2019-05-29收稿 责任编辑：杨觉雄）