毛细管电泳法检测血清蛋白电泳的性能评估

安崇文，李海霞，焦莉莉

(北京大学第一医院检验科，北京 100034)

血清蛋白电泳(SPE)是对血清中蛋白质进行质和量筛查的一种常见方法，尤其在肾病(如肾病综合征、单克隆免疫球蛋白相关肾损伤)、肝硬化和浆细胞病(如多发性骨髓瘤)患者最具有特征性的变化，也是临床对M蛋白血症筛查最常见的一种手段，临床诊断上意义重大，其诊断性能特征决定性取决于分析技术和评估质量[1]。目前，国内对于醋酸纤维素薄膜电泳法(CAE)和琼脂糖凝胶电泳法(AGE)检测SPE已有报道[2-5]，国内采用毛细管电泳法(CE)检测SPE大多使用法国Sebia Capillarys电泳仪，相关研究也是基于该仪器的结果[6]，国内有关Helena V8全自动毛细管电泳仪的研究少见报道。本研究采用美国临床和实验室标准化协会(CLSI)EP文件对该仪器检测SPE的性能进行评价，为其在临床实验室的应用提供帮助。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 检测系统为配套系统，应用Helena V8全自动毛细管电泳仪，检测系统试剂(Serum Protein SPE Kit批号：11471987，Storage Buffer批号：11512830，Maintenance Buffer批号：11494749，Serum Control-Normal批号：11394452，Serum Control-Abnormal批号：11404273)。

1.2评价方法 参考CLSI提出的EP评价方案对检测系统性能进行评估。

1.2.1精密度评估 参考CLSI EP5-A2文件[7]进行确认。

1.2.2正确度评价 参考CLSI EP15-A2[8]推荐的分析具有指定值的物质，对2016年和2017年度美国病理学家协会(CAP)发放的室间质评物(ELP-A、ELP-B)及原卫生部临床检验中心发放的室间质评物及厂家提供的指定值物质进行测定。

1.2.3相关性和偏差分析 参考CLSI EP9-A2文件[9]，选取本院患者血清标本40份，其SPE结果涵盖正常和异常标本。分析系统间的相关性和偏差,并计算生物参考区间水平时的预期偏差(Bc)。以原卫生部临床检验中心室间质评(EQA)标准的允许总误差评判是否可接受，清蛋白(ALB)、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白允许偏差分别为10%、15%、15%、15%、10%。

1.2.4生物参考区间验证 参考CLSI C28-A3c文件[10]，选取本院健康体检人员男女各60例，年龄19～78岁，中位年龄42岁。结果与厂家给定的参考区间进行比较，以≤2例的检测结果在给定参考区间外作为可接受标准。

1.2.5稳定性评估 取8份患者血清，于采集2 h内进行SPE检测，分别于室温(18～28 ℃)避光、4 ℃避光、-20 ℃避光条件下保存，标本采集后4、8、12 h及第1～10天进行SPE检测，与采集2 h内检测结果进行比较并计算平均偏差。

1.2.6M蛋白筛查情况评估 病例组选取89例免疫固定电泳法阳性的血清标本，对照组选取81例免疫固定电泳法健康体检人员血清标本，将结果整理成四格表进行真实性评价统计。

1.3统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析处理。采用Pearson相关进行相关性分析；偏差分析采用方差分析及Bland-Altman 差异分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1精密度评估 利用EP5-A2精密度方案进行验证，结果符合要求，见表1。

表1 SPE EP5-A2的精密度验证结果(%)

2.2正确度验证

2.2.1检测原卫生部临床检验中心EQA物质的偏差结果 原卫生部临床检验中心规定的允许总误差，ALB、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白分别为20%、30%、30%、30%、20%，见表2、表3。

表2 检测原卫生部临床检验中心EQA物质的偏差结果(%)

表3 检测CAP能力验证物质的偏差结果(%)

2.2.2检测Helena厂家提供具有指定值物质的偏差结果 由于上述评价物质均不能把β1和β2球蛋白组分区分开，故本研究又采用了厂家提供的具有指定值的评价物质，其验证结果见表4，通过验证。

2.3相关性和偏差分析 CE和AGE检测SPE呈正相关，ALB、α1球蛋白、α球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白相关系数(r)分别为0.958 0、0.609 0、0.945 9、0.910 1、0.975 2(P<0.01)，其中仅α1球蛋白显示为中度相关；对CE和AGE检测结果进行方差分析，F值均大于F0.01(1.40)=7.31，证实二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。偏差分析显示，平均绝对偏差分别为-4.14%、2.80%、-1.86%、1.24%、1.98%，平均相对偏差为-7.79%、124.61%、-18.24%、11.33%、14.87%。CE和AGE检测α1、α2球蛋白结果间存在明显差异，结果一致性较差，无可比性，见表5。

表4 检测Helena厂家提供具有指定值物质的偏差结果(%)

表5 CE系统在参考区间处可接受性评估(%)

2.4参考区间验证 男性和女性生物参考区间验证结果见表6、表7、图1。α2球蛋白、β1球蛋白、γ球蛋白超出了规定数量，验证不通过，证明厂家提供的美国人参考区间不适合我国人群。

表6 男性生物参考区间验证结果(n=60)

2.5不同温度条件下稳定性试验偏差结果 比较8份标本在4 h至第10天不同温度、不同时间条件下与采集2 h内结果的差异，见表8～10，变化明显的为β2球蛋白，其在室温和4 ℃避光保存平均偏差呈负增长趋势，-20 ℃避光保存平均偏差均<10%；如果以偏差<10%为标准，提示室温不宜超过8 h，4 ℃冰箱不宜超过4 d，-20 ℃避光保存10 d结果可接受。

表7 女性生物参考区间验证结果(n=60)

图1 双清蛋白血症SPE图谱

表8 室温条件下稳定性试验偏差结果(%)

表9 4 ℃避光条件下稳定性试验偏差结果(%)

续表9 4 ℃避光条件下稳定性试验偏差结果(%)

表10 -20 ℃避光条件下稳定性试验偏差结果(%)

2.6CE检测M蛋白真实性评价结果 CE检测M蛋白的灵敏度为0.753，特异度为0.988，ROC曲线下面积为0.870，95%CI为0.813～0.928。见表11。

表11 CE检测M蛋白真实性评价结果(n)

3 讨 论

本研究评价的CE检测SPE的批内、批间CV均小于我国原卫生部临床检验中心规定的1/4和1/3允许总误差，而且均小于文献[2-5]报道的CAE和AGE的精密度，在重复性上CE较凝胶法有明显优势，这可能是因为，一般基于凝胶条件下的电泳其蛋白质的分布是先在凝胶载体上进行定性，然后再基于染料的结合量进行半定量，属于定性-半定量检测。而CE是通过214 nm处的紫外光检测蛋白质肽带直接进行半定量检测。

正确度验证显示，对原卫生部EQA和美国CAP能力验证物质进行测定，结果均通过验证，而本研究也同时检测第3方机构(伯乐)提供的物质，α1球蛋白未通过验证，相对偏差已远远超出允许总误差(±30%)，分析原因可能与靶值制订有关。而伯乐提供的靶值未把CE结果纳入其中。由于上述评价物均不能把β1球蛋白和β2球蛋白组分区分开，故本研究又采用了厂家提供的具有指定值的评价物质，结果通过验证。

相关分析显示，CE和AGE检测SPE呈正相关，仅α1球蛋白组分显示为中度相关(r=0.609 0)，其余均显示为高度相关。CE和AGE检测结果经方差分析显示，二者差异有统计学意义(P<0.05)。偏差分析显示，α1球蛋白、α2球蛋白、γ球蛋白的平均相对偏差为124.61%、-18.24%、14.87%，均超出了规定。α1球蛋白、α2球蛋白在生物参考区间处的预期偏差也不可接受。整体来看CE与AGE检测α1球蛋白、α2球蛋白、γ球蛋白结果存在明显差异，结果一致性较差，无可比性，这与该组分中蛋白质所含的脂类或糖类多少有关，这些脂类或糖类是不能被蛋白染料着色的，如脂蛋白中的脂类和α1酸性糖蛋白中的糖类(如唾液酸)，α1酸性糖蛋白含糖量为45%，这些物质在基于凝胶的电泳中都会影响与染料结合，导致蛋白检测比实际偏低。而在CE中应用的是直接紫外吸光度测量，不受这些脂类和糖类的影响，这是造成CE检测α1球蛋白等组分与AGE偏差较大的原因，故CE的α1球蛋白组分参考区间也会明显高于凝胶法。

生物参考区间验证显示，α2球蛋白、β1球蛋白、γ球蛋白超出了规定数量，验证不通过，证明厂家提供的39例美国人参考区间不适合我国人群，实验室应制订本实验室的参考区间。在验证期间发现1例双清蛋白血症标本(图1)，CE显示ALB组分明显分出2个峰，而AGE的ALB区带并未出现2条条带，而是出现1条较宽条带，这可能与CE检测SPE时增加了ALB组分的分辨率有关，导致CE对双清蛋白血症的检测更加灵敏，这与国外报道采用CE比AGE发现双清蛋白血症例数多是相符的[11]。本例双清蛋白血症个体属于健康体检人员，并未大量使用抗菌药物(如青霉素)和水杨酸等，也无胰腺疾病，可能与ALB的遗传性基因变异相关，ALB有20多种遗传变异，而这些个体是可以不表现出病症的。

标本稳定性试验显示，β2球蛋白组分变化最明显，这与血清中补体蛋白性质不稳定有关。补体蛋白占总蛋白的10%左右，其中补体C3、C4属于β球蛋白，补体C3又是水平最高的，而β2球蛋白组分中主要是C3蛋白，易受各种理化因素的影响，温度过高、紫外线照射等均可遭到破坏，在室温和4 ℃保存时间越长，β2条带越不清晰。故建议室温避光保存8 h，4 ℃避光保存4 d，这与文献[6]报道有差异。

对于SPE而言，最重要的就是发现并定量单克隆蛋白质(即M蛋白)，而CE筛查M蛋白的灵敏度不仅与AGE一致性较好[12-13]，还可以对M蛋白进行定量检测。本研究的灵敏度为0.753，准确度为0.988，ROC曲线下面积为0.870，由此证实CE对于筛查M蛋白有良好的准确度，诊断价值较大。

本研究在筛查M蛋白试验中，81例对照组中有1例采用CE检测为M蛋白假阳性，分析原因可能与该标本为高球蛋白血症有关。增多的IgA导致β2区峰值或β2与γ区间峰值增大造成错误解读。89例M蛋白阳性标本中，有22例未被CE检出，经免疫固定电泳法检测其中8例为轻链型(7例弱阳性、1例与β区重合)，2例为IgAλ型(与β重合)，3例为IgGλ型(弱阳性)，2例为IgMλ型(弱阳性)，4例为IgMκ型(3例弱阳性、1例与β区重合)，1例为IgAκ型(与β区重合)，1例为IgGκ(弱阳性)和1例为IgG、IgM、κ、λ寡克隆型，综合分析，可能被CE漏检的M蛋白为单克隆轻链型患者、单克隆蛋白与β区或β1区重合的患者、低水平单克隆蛋白患者和寡克隆或双克隆蛋白水平少的患者等。当患者存在少量M蛋白时，尤其背景中再加上多克隆免疫球蛋白增值的情况下，这些隐藏在正常区带中的小单克隆蛋白是很难被CE和AGE检出的，这种小单克隆蛋白的存在虽然尚未确定临床意义，但它是反映疾病情况的线索，应加以重视[14]，如B细胞淋巴瘤、白血病、化学免疫抑制剂作用、原发性巨球蛋白血症、重链病、轻链病、原发性淀粉样变性、意义未明的单克隆免疫球蛋白血症、多神经病、皮肤黏液水肿样苔藓、多种慢性感染、结缔组织病、非网状内皮系统肿瘤、脂肪代谢障碍、慢性肝病、病毒感染、药物过敏、癌肿、恶性淋巴瘤、自身免疫性疾病和免疫复合物疾病等均可能出现小单克隆蛋白区带，同时进行免疫固定电泳法检测可弥补上述不足。

4 结 论

CE检测SPE的优势在于增加了ALB、β球蛋白组分的分辨率，并且可对M蛋白进行量化，使双清蛋白血症更易检出，区分开β1和β2球蛋白组分，β1球蛋白中主要是转铁蛋白，β2球蛋白中主要是补体C3，若M蛋白在β2区，AGE由于重合，很难分辨出来，而CE会使与β2区重叠的M蛋白更易检出，可为临床诊断和治疗提供更多信息。