肺泡灌洗液和痰液涂片抗酸染色半定量与GeneXpert MTB/RIF半定量分析临床应用*

刘桂治，周 旋,林茂锐，李明友,孙 亮，余子龙，曹东林

(广东省第二人民医院检验医学部,广东广州 510317)

一直以来，结核病都是受全世界关注的公共卫生问题。根据我国结核病患者登记情况,广东省是结核疫情最为严重的几个区域之一[1-3]。GeneXpert MTB/RIF是近年来实验室诊断结核病的新兴技术，因其方便、快捷、灵敏度高，已在临床广泛应用[4-5]。随着2017年颁布的新版肺结核诊断标准中加入支气管镜检查及气管、支气管结核镜下表现，肺泡灌洗液逐渐成为GeneXpert MTB/RIF检测的主要标本[2]，结核杆菌载量的半定量对结核病患者的追踪治疗观察有重要价值。本研究拟回顾性调查分析GeneXpert MTB/RIF技术和结核涂片抗酸染色半定量在临床中的应用，探讨不同类型的标本应用于该项诊断新技术对结核病诊治的指导意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性调查分析本院2017年6月至2019年6月送检的肺泡灌洗液患者820例，其中男499例，女321例，年龄15～89岁。回顾性调查分析本院同期疑似结核病患者249例，比较GeneXpert MTB/RIF半定量检测与涂片抗酸染色半定量检测结果。

1.2研究方法

1.2.1肺泡灌洗液与痰液标本准备[1]肺泡灌洗液收集：按照病变部位选择灌洗肺段，将电子支气管镜顶端插入肺段支气管开口处，经活检孔注入2%利多卡因2 mL行肺段局部麻醉，然后注入37 ℃生理盐水5～10 mL，重复灌洗肺部2～3次，收集肺泡灌洗液约15 mL，3 000 r/min离心15 min备用。痰液标本：患者晨起立即用清水漱口后，咳出深部的第2口、第3口痰液。收到痰液后进行痰液常规判断是否为合格痰液，若不合格嘱其重新留取。

1.2.2涂片抗酸染色 取0.05～0.10 mL患者痰液标本或肺泡灌洗液沉渣标本在玻片上涂抹成卵圆形的膜，面积为1 cm×2 cm，萋-尼氏染色法抗酸染色，镜检，涂片检查按《中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[1]操作。按照萋-尼氏染色镜检结果分级报告，抗酸杆菌阴性(-)：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌，报告抗酸杆菌菌数1～8条/300视野；抗酸杆菌阳性(+)：3～9条/100 视野；抗酸杆菌阳性(++)：1～9条/10视野；抗酸杆菌阳性(+++)：1～9条/每个视野；抗酸杆菌阳性(++++)：≥10条/每个视野。抗酸染色液试剂盒由珠海贝索生物技术有限公司提供。

1.2.3GeneXpert MTB/RIF技术 GeneXpert MTB/RIF系统和检测试剂盒由赛沛(上海)商贸有限公司提供。GeneXpert MTB/RIF技术不同标本类型按照仪器说明书规范操作。结核分枝杆菌检测基于标本中结核分枝杆菌的Ct值，结果将以高、中、低或非常低来显示，其中Ct<16为高水平，Ct为16～22为中等水平，Ct>22～28为低水平，Ct>28为极低水平。

2 结 果

2.1支气管肺泡灌洗液标本的科室分布 在所有送检标本中，呼吸与危重症医学科送检率最高，为38.54%,其次是重症监护室，为24.51%，其余科室送检率较低，见表1。

表1 支气管肺泡灌洗液标本的科室分布(n=820)

表2 GeneXpert MTB/RIF技术与涂片抗酸染色法检测结果比较

2.2GeneXpert MTB/RIF技术与涂片抗酸染色法检测结果比较 根据2017年肺结核诊断标准，挑选符合临床诊断的病例249例，将249例按照标本类型分类，GeneXpert MTB/RIF技术与涂片抗酸染色法检测结果见表2。结果显示，痰液(137例)和肺泡灌洗液(104例)占大部分，其他标本类型如脑脊液(4例)、大便(2例)和关节穿刺液(2例)较少。其中痰液阳性预测值和阴性预测值分别为36.6%、95.5%；肺泡灌洗液的阳性预测值和阴性预测值分别为43.2%、98.3%。

2.3肺泡灌洗液与痰液在不同涂片半定量时GeneXpert MTB/RIF的Ct值比较 对GeneXpert MTB/RIF阳性标本(肺泡灌洗液44例，痰液71例)按照涂片半定量标准分类后比较，当涂片半定量结果为(-)、(+)时，肺泡灌洗液在进行GeneXpert MTB/RIF检测时Ct值明显不同于痰液，差异有统计学意义(P<0.05)； 当涂片半定量结果为(++)、(+++)、(++++)时，肺泡灌洗液在进行GeneXpert MTB/RIF检测时Ct值与痰液差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 肺泡灌洗液与痰液在不同涂片半定量时GeneXpert MTB/RIF的Ct值比较

3 讨 论

2011-2015年我国共登记结核病患者发病4 562 613例，死亡12 598例，其中仅培养阳性患者发病11 692例，患者的地区分布最高为广东省[3]，这可能与广东人口密度较高，空气潮湿闷热，使结核杆菌很容易传播有关。目前，虽然我国结核病患者的数量正在逐年减少，但每年仍然有高达80多万的发病数，表明我国在结核病的防治道路上依然任重道远。已有研究表明，早期诊断和合理的治疗对结核病的控制极为重要[1]。许多结核病疑似患者并没有典型的影像学征象，部分初发患者也缺乏典型的临床症状，因此，实验室检查就显得尤为重要[6]。GeneXpert MTB/RIF技术是一项以结核分枝杆菌核酸扩增为基础的全自动分子诊断方法，因其实验环境要求简单，操作容易，实验人员技术要求门槛低，所以在世界范围内容易推广[7-8]。2017年颁布的新版肺结核诊断标准已经将结核分枝杆菌核酸检测加为确诊条件之一[2]。

随着2017年颁布的新版肺结核诊断标准里加入支气管镜检查及气管、支气管结核镜下表现[2]，呼吸科及重症监护室等结核重点监护科室对支气管镜诊疗日益重视，肺泡灌洗液送检比例大大提高。本研究回顾性分析结果显示，本院2017年6月至2019年6月肺泡灌洗液送检科室以呼吸与危重症医学科及重症监护室最多。其他科室送检率较低，虽然与患者类型分布有极大联系，但其他科室对支气管肺泡灌洗液的诊断价值认识仍存在不足。将符合临床诊断的标本(249例)的GeneXpert MTB/RIF技术检测结果与对应涂片抗酸染色法结果进行比较，提示痰液和肺泡灌洗液标本阴性预测值较高(95.5%～98.3%)，与其他研究较为接近[9]，而阳性预测值较低(36.6%～43.2%)，这可能与综合性医院相对于传染病专科医院，初次就诊患者较多有关。其余标本类型由于数据有限，其预测价值有限，其中4例GeneXpert MTB/RIF技术检测阴性，而涂片抗酸染色法阳性患者为非结核类分枝杆菌污染导致。表明GeneXpert MTB/RIF技术能够大大提高结核病的阴性预测值，准确区分结核分枝杆菌与其他抗酸阳性的非结核分枝杆菌，这在其他研究中也有类似结论[10-11]。因此，对于结核患者的诊断，仍需结合其他影像学或病原生物学结果综合分析。

结核杆菌的半定量对结核病患者的追踪治疗及观察具有重要价值[1]，但GeneXpert MTB/RIF技术采用的半定量检测与传统的涂片抗酸染色半定量方法是否有一定相关性尚不清楚。本研究对临床确诊的结核患者回顾性调查发现，在GeneXpert MTB/RIF技术检测阳性的标本中，当涂片抗酸染色半定量结果为(-)、(+)时，GeneXpert MTB/RIF检测各组Ct值差异均有统计学意义(P<0.05)，说明GeneXpert MTB/RIF技术检测Ct值对结核杆菌半定量有一定的提示作用。肺泡灌洗液应用于GeneXpert MTB/RIF技术检测是否优于痰液？本研究调查表明，当涂片抗酸染色半定量结果为(-)、(+)时，肺泡灌洗液在进行GeneXpert MTB/RIF检测时Ct值与痰液差异有统计学意义(P<0.05)；当涂片半定量结果为(++)、(+++)、(++++)时,肺泡灌洗液在进行GeneXpert MTB/RIF检测时Ct值与痰液差异无统计学意义(P>0.05)。表明在结核患者细菌载量较高的情况下，采集肺泡灌洗液或痰液进行GeneXpert MTB/RIF技术检测对病原学检测结果判定影响不大，当细菌载量涂片抗酸染色半定量为(-)、(+)时，留取肺泡灌洗液有助于提高检出率，这与邱文娜等[12]的研究有一定区别，在他们的研究中总体认为GeneXpert MTB/RIF技术检测肺泡灌洗液灵敏度更高，这可能是因为他们没有对细菌载量半定量区分的原因。在细菌水平较低时，进行针对性的肺段冲洗能够增加结核杆菌的获取概率，而痰液中经常混合口咽部其他杂菌，这些杂菌对结核杆菌的核酸扩增也会产生一定程度的抑制。当结核杆菌细菌载量较高时，结核杆菌的核酸水平和纯度已经足够高，在不同类型标本中扩增差异不大。因此，支气管镜诊疗的推广应用是结核病防治能力提高的一项重要措施[13]。

4 结 论

结核病的实验室诊断技术已取得极大的进展，新的检测技术大大提高了结核病诊断的灵敏度和特异度，但不管是哪种检测技术，均存在一定的局限性[14]。在研究新技术GeneXpert MTB/RIF应用深度的同时也要扩展其广度，本研究提示，肺泡灌洗液相对于痰液在结核杆菌低载量时应用GeneXpert MTB/RIF技术具有更好的提示作用。未来联合多种检测技术，对疑似结核病患者同时进行诊断，综合分析检测结果，将成为结核病防治的重要方向。