白细胞介素-6、微小RNA-210与子痫前期的相关性及其临床价值*

2020-11-18段玉萍钟丽丽蔡雷鸣吴晶晶

国际检验医学杂志 2020年21期

段玉萍,钟丽丽,洪茂,谢骊,蔡雷鸣,吴晶晶,陈雄,厉倩△

(上海市宝山区吴淞中心医院：1.检验科；2妇产科，上海 200940)

子痫前期(PE)是一种常见的妊娠期特发的多系统紊乱综合征，全球发病率为2%～8%，是孕产妇发病率和病死率最高的疾病之一，以妊娠20周后新发的高血压和蛋白尿为主要临床症状[1]。PE病因的异质性很强，其发病机制尚不完全清楚，被认为是一种胎盘源性疾病，去除胎盘才能根治PE。PE的预测对于早期预防、治疗及降低母婴病死率有重要意义，但目前还没有特别有效、可靠和经济的预测方法。缺氧、内皮细胞功能紊乱和无菌性系统性炎症被认为在PE发病机制中发挥重要作用[1-2]。微小RNA-210(miR-210)是低氧诱导的微小RNA，已有报道miR-210在PE患者胎盘和血清中表达水平升高[3-4]。miR-210可通过抑制靶基因的表达而发挥调控作用。炎症因子白细胞介素-6(IL-6)与妊娠及PE的发病关系密切，PE患者孕中晚期IL-6水平升高[5]，但PE患者外周血中升高的miR-210与IL-6水平是否存在相关性尚少见相关报道。本文采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验分别检测PE患者和正常妊娠女性不同孕期血清miR-210、IL-6表达水平，探讨血清miR-210及IL-6在正常妊娠女性及PE患者妊娠过程中的变化规律，分析miR-210和IL-6的相关性及临床价值。

1 资料与方法

1.1一般资料经过本院伦理委员会批准，本研究纳入2015年1月至2018年12月在本院分娩的PE产妇(PE组)和无明确妊娠相关疾病产妇(对照组)各82例作为研究对象。PE的诊断标准参考第9版《妇产科学》[6]：在妊娠20周后出现收缩压≥140 mm Hg和(或)舒张压≥90 mm Hg，伴尿蛋白≥300 mg/24 h，或随机尿蛋白(+)，或虽无蛋白尿但合并有下列任何一项者。血小板减少、肝功能损害、肾功能损害、肺水肿、新发中枢神经系统异常或视觉障碍。本研究所有研究对象排除妊娠感染、妊娠期糖尿病，且均为单胎妊娠，对照组和PE组一般资料具有可比性，两组孕妇年龄、孕前体质量指数(BMI)和初胎比例比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。对照组孕早期(12～14周)、孕中期(20～24周)和孕晚期(28～32周)血液标本均为82例，初胎比率为48.8%(40/82)，年龄22～37岁，孕前BMI(21.7±3.3)kg/m2；PE组完成孕早期标本收集70例、孕中期标本收集80例、孕晚期标本收集82例，初胎比率为46.3%(38/82)，年龄22～38岁，孕前BMI(23.1±3.5)kg/m2，PE诊断孕周(35.1±2.8)周。

1.2标本采集、处理及保存采用真空采血管采集研究对象空腹全血标本3～5 mL，静置20 min后用离心力1 500×g首次离心10 min，收集上层血清后用12 000×g离心力二次离心10 min，转移上清液至无RNA酶的无菌容器中，-80 ℃保存备用。

1.3血清RNA提取采用试剂盒miRNeasy Serum/Plasma kit(Qiagen)提取血清中总RNA，操作步骤参见本课题组已经发表的文章[7]，简述如下：将1 mL的Trizol 溶解液加入200 μL血清中，充分颠倒混匀后室温静置2 min后加入3.5 μL的cel miR-39(1.6×108/μL,Qiagen)作为内参，然后依次用三氯甲烷、无水乙醇、缓冲液、80%乙醇溶液等，末次洗涤后的洗脱柱高速离心5 min，最后加入14 μL无RNA酶水溶解总RNA。

1.4反转录PCR和荧光定量PCR 采用二步法分别进行反转录和荧光定量PCR[7]。采用反转录试剂盒miScript Ⅱ(Qiagen)合成cDNA第1链(加尾法)，将总体积为20 μL的反转录体系置于扩增仪(Bioer)中，反转录条件为37 ℃ 1 h、95 ℃ 5 min。采用荧光定量PCR试剂盒miScirpt SYBR green PCR(Qiagen)和PCR扩增仪ABI 7500进行荧光实时定量PCR。PCR反应体系总体积为20 μL，其中含2 μL 100倍稀释的cDNA[7]。以RNA抽提过程中加入的cel-miR-39为内参基因。cel-miR-39和miR-210分别在两孔中进行扩增，每个标本每个基因均设置3个平行复孔，Ct值取3孔平均值。单个标本miR-210的表达水平用相对miR-39的Ct差值表示，miR-210差异表达的相对定量分析用2-ΔΔCt法。

1.5血清IL-6水平测定采用酶联免疫吸附试验试剂盒(BD)检测孕妇血清IL-6水平，具体操作步骤参见说明书，该试剂盒的检出限为2.2 pg/mL，且重复性、精密度和中间精密度均<10%。

2 结果

2.1PE组和对照组孕早、中、晚期血清IL-6表达水平比较对照组不同孕期的血清IL-6表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。PE组孕晚期IL-6表达水平明显高于孕早期和孕中期，差异均有统计学意义(P<0.05)。PE组孕晚期IL-6表达水平明显高于对照组孕晚期，差异有统计学意义(P<0.05)，PE组孕中期IL-6表达水平虽然高于对照组，但差异无统计学意义(P=0.12)。PE组和对照组孕早期IL-6表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 PE组和对照组孕早、中、晚期血清IL-6表达水平比较[ M(P25～P75)，pg/mL]

2.2PE组和对照组孕早、中、晚期血清miR-210表达水平比较对照组不同孕期的血清miR-210表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。PE组孕晚期miR-210表达水平明显高于孕早期和孕中期，差异均有统计学意义(P<0.05)。PE组孕中期和孕晚期miR-210表达水平均明显高于对照组孕中期和孕晚期，差异均有统计学意义(P<0.05)；PE组和对照组孕早期miR-210表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 PE组和对照组孕早、中、晚期miR-210表达水平比较

2.3孕早、中、晚期血清IL-6和miR-210相对表达水平相关性分析进一步对血清IL-6和miR-210的表达水平进行相关性分析发现，血清IL-6和 miR-210的表达水平呈正相关(r=0.57，P<0.01)。见图1。

图1 血清IL-6和miR-210表达量的相关性分析

3 讨论

本研究通过分析PE患者和正常妊娠女性孕早、中、晚期血清miR-210和IL-6表达水平变化发现，在正常妊娠过程中，外周血miR-210、IL-6表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，但在PE患者妊娠过程中，在孕20周后miR-210表达水平升高，在妊娠28周后IL-6水平明显增加，且miR-210与IL-6的表达呈正相关。miR-210是低氧诱导的微小RNA，低氧环境可以通过增加低氧诱导因子1α的表达使miR-210水平上调[8]。除了低氧，氧化应激压力和炎症也能调节miR-210的表达水平。IL-6是gp130家族的细胞因子，可由多种细胞分泌，IL-6通过细胞膜上的gp130向JAK/STAT3通路传递信号，参与免疫反应、急性时相反应。

胎盘灌注不足进而引起全身各系统灌注减少，是PE的重要特征。PE是一种动态性疾病，病情可呈持续性发展，主要临床表现为妊娠20周后出现高血压和蛋白尿，部分患者有多脏器和多系统损害，严重者可发生子痫[9]。胎盘灌注不足引起的胎盘低氧环境导致大量毒性因子释放进入外周循环，进而引起内皮细胞功能紊乱、血管收缩、血压升高，出现多系统功能紊乱，这是PE的基本病理变化。本研究中PE患者孕中、晚期miR-210表达水平升高的结果与PE患者全身低灌注的病理变化相符，也与文献[3-4]报道一致。胎盘中升高的miR-210可能以外泌体的形式分泌到外周血中[10]，进而引起外周血中miR-210表达水平升高。上调的miR-210可通过抑制HOXA9、EFNA3、THSD7A等靶基因的表达，减弱滋养细胞的迁移和侵袭能力[3-4]，但这个过程与PE的病因相关，发生在妊娠20周前。miR-210上调可能是PE的病因，也可能是PE的表现，本研究中PE患者孕中、晚期外周血miR-210水平升高的结果提示，miR-210水平升高可能是PE的一种反馈性机制，这种反馈性机制是保护性还是危害性尚不得而知。

从免疫学角度看，妊娠是一个同种异体的移植过程，是一个全身低度无菌炎症状态，表现为妊娠女性的白细胞增多、补体活化等，难治性高血压、蛋白尿等PE临床症状是全身失控性炎性反应的表现[11]。有文献报道，PE患者孕中、晚期外周血炎症因子IL-6水平明显高于正常妊娠女性，且重度PE患者的循环IL-6水平高于轻度PE患者，IL-6可以进一步诱导内皮细胞产生内皮素1(ET-1)，ET-1与血管舒缩、水钠潴留密切相关，IL-6中和抗体使PE小鼠的高血压和蛋白尿水平降低[5,12-13]，说明IL-6在PE的发病过程中发挥重要作用,降低IL-6水平可能控制PE的临床症状，从而延长妊娠时间，使母婴受益最大化。但也有研究指出，PE患者的外周血IL-6水平与正常妊娠女性无差异[14-15]，这可能与标本的采集时间(孕周、是否空腹)及研究对象的组成差异相关。本研究所有标本均为空腹采集，两组研究对象孕前BMI无明显差异，排除了感染、糖尿病等其他妊娠并发症，PE患者在妊娠28周后血清IL-6水平高于同孕周的对照组，支持PE患者孕后期IL-6水平升高的论点。

本研究通过分析正常妊娠女性及PE患者不同孕期血清miR-210和IL-6的相关性发现，miR-210与IL-6呈正相关，miR-210可能通过某种机制与炎性反应、IL-6分泌关联，这可能对PE的发病机制研究有一定意义。本研究通过探索妊娠各期外周血中miR-210、IL-6的水平变化规律发现，PE患者孕中、晚期miR-210和IL-6表达水平上调，其表达上调先于PE的临床诊断，提示血清miR-210和IL-6可能是PE的预测和诊断生物标志物。但由于本研究的病例数有限，且未对PE的疾病严重程度进行分类，其结果可能具有一定程度的偏倚，有待更多的研究来证实。