酵母菌株对余甘子酒香气成分及感官品质的影响

李 洁，郑涵予，王沂雯，钟 焱，刘兴艳，陈安均

（四川农业大学食品学院，四川雅安62500）

【研究意义】余甘子（Phyllanthus emblicaL.）是一种大戟科中小型落叶乔木的果实，主要生长在中国、印度等亚热带和热带地区[1]。余甘子含丰富的营养，可作为矿物质、氨基酸和抗坏血酸的重要膳食来源[2]。余甘子还含有黄酮、多酚、生物碱、有机酸和甾醇等具有抗氧化能力和清除自由基能力的生物活性物质，有降血压、降血脂、抗肿瘤、防止动脉粥样硬化、消炎镇痛、增强免疫等功能[3]。中国余甘子产量大，大多长在山区，开发利用率很低，造成资源浪费和山区经济的落后，若将余甘子开发成果酒将有利于资源的合理利用和促进山区经济的发展[4]。【前人研究进展】果酒的香气主要是通过果实发育和果酒发酵过程产生的一系列如醇类、酯类、醛类等香气成分[5]，作为果酒品质的重要指标之一，其香气直接影响果酒的风味品质。杨婷[6]等研究表明4 株不同的酿酒酵母发酵产生的甜瓜酒的香气含量及香气特征之间存在差异性；李凯[7]等研究发现不同商业酿酒酵母酿制的玫瑰香葡萄酒的香气轮廓存在差异。目前暂无对余甘子酒的挥发性香气成分的研究。【本研究切入点】传统的感官评价是评定果酒感官质量最有效可行的方法，但容易受较多主观因素影响，采用GC-MS可以有效地分离出酒中的香气成分并作出鉴定[8]。【拟解决的关键问题】本试验以凉山野生余甘子为原料酿制余甘子果酒，探究不同的酵母菌株对余甘子酒挥发性香气成分及感官质量的影响，并采用模糊综合评判将感官质量与挥发性香气成分结合以期筛选适合余甘子酒的酵母菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

余甘子：购自凉山州盐源县金河乡；5 株活性干酵母菌株：EC1118 和D254 为法国拉曼公司产品，Top15、Aroma white和Perlage为意大利英纳帝斯公司产品。

发酵助剂：酵母多糖，爱赛科有限公司。添加发酵助剂的主要作用是为提高酵母发酵速率，使酵母发酵彻底。

壬酸甲酯标准品，美国sigma 公司；果胶酶（5 万U/g），宁夏和氏璧生物技术有限公司；DPPH，2，4，6-三吡啶基三嗪、亚硝酸钠、硝酸铝、抗坏血酸、没食子酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C GC-MS，美国安捷伦公司；3001-2207 全波段酶标仪，赛默飞世尔科技有限公司；DNP-9162电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 余甘子酒的加工工艺 余甘子→挑选清洗→去核→酶解→糖水混合→成分调整→接种酵母→添加发酵助剂→倒罐→后发酵→陈酿，操作要点如下。

（1）酶解：添加0.01 g/kg的果胶酶，40 ℃酶解3 h，然后95 ℃灭酶5 min；

（2）糖水混合：余甘子原料含水量较少，TSS为14.5%，将余甘子果肉与糖水按1:2混合打浆使余甘子果浆的TSS为23%；

（3）成分调整：余甘子果浆的pH值较低为2.7，不利于酵母菌株的发酵，因此将果浆调整pH值为3.3，并加入80 mg/L SO2密封3 h；

（4）接种酵母：按总体积称取0.25 g/kg的活性干酵母，然后加入至20 mL 10%糖水中，38 ℃活化0.5 h后添加至发酵罐中[9]；

（5）添加发酵助剂：取0.4 g/L的酵母多糖，用少量水溶解，在总糖消耗掉1/3时添加；

（6）后发酵：待发酵14 d 后将余甘子酒用300 目滤袋去除果肉后放置于1 000 mL 广口瓶中于干燥的环境中进行后发酵。后发酵期间温度控制在20～25 ℃，密封好广口瓶尽量避免与空气接触以防止杂菌的污染。

（7）发酵终点：根据CO2失重法，待酒液质量基本保持不变时结束发酵。

（8）陈酿：在发酵好的余甘子酒中加入50 mg/L 的SO2后放置在室温下进行密封陈酿。陈酿时间为2～3个月。

1.3.2 余甘子酒指标的测定 （1）酒精度、总糖、挥发酸、总酸、甲醇：参考GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[10]；

（2）挥发性香气成分：参考刘娟[11]的方法，具体如下：

固相微萃取条件：取8 mL酒样、30%NaCl和5.0µL 200 mg/L环己酮于15 mL顶空固相微萃取样品瓶中，加盖密封后在60 ℃的气浴恒温震荡器下震荡10 min。将萃取头（30/50µm DVB/CAR/PDMS）插入顶空固相微萃取样品瓶中推出纤维于60 ℃水浴锅下萃取吸附30 min后取出进行气质测定。

GC 条件：HP-5MS 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm），不分流进样，柱温采用程序升温，40 ℃保持8 min，以5 ℃/min 升至185 ℃保持1 min，再以10 ℃/min 的速度升至230 ℃保持23 min，总用时65 min，进样口温度260 ℃，检测器温度250 ℃，载气He，流速为1.0 mL/min。

MS 条件：电离方式EI，电离电压70 ev，灯丝电流0.25 mA，电子倍增器电压为1 500 V，扫描范围30～350 m/z。

（3）感官评定：待发酵结束后余甘子果酒陈酿3 个月后进行感官评价。评分标准参考魏永春等的标准[12]略作修改，具体见表1。

表1 余甘子酒感官评定标准Tab.1 Sensory evaluation criteria for Phyllanthus wines

1.4 数据分析

实验设3次重复，数据以平均值±标准偏差（SD）表示。使用SPSS 20.0软件作统计分析以及主成分分析（PCA）。差异的显著性水平为P<0.05，不同字母表示具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 酵母菌株对余甘子酒基础理化指标的影响

研究了5 株酵母菌株所发酵余甘子酒基础理化指标，由表2 可知，5 种余甘子酒的酒精体积浓度在10.50%～11.11%，Perlage 酿制的余甘子酒酒精体积浓度显著低于其他酒（P<0.05），同时酒精体积浓度含量最低，这表明Perlage 酵母的糖利用率要低于其余4 种酵母；5 种酒样的甲醇含量在0.16～0.28 g/L，Perlage 与EC1118 酿制的余甘子酒甲醇含量显著低于其他酒（P<0.05）。EC1118 和Top15 酿制的余甘子酒挥发酸含量较低，分别为0.41 和0.42 g/L；D254 酿制的余甘子酒挥发酸含量最高，为0.67 g/L。5 种余甘子酒总酸含量在8.15～9.34 g/L，pH 值在3.42～3.52，果酒中适量的酸能够柔和其苦涩味，且高酸产生的低pH 环境能够防止杂菌污染[13]。

表2 酵母菌株对余甘子酒基础理化指标的影响Tab.2 Effect of yeast strains on basic physical and chemical indicators ofPhyllanthuswines

2.2 不同酵母所发酵余甘子酒的挥发性香气成分

由表3 可知，5 种酵母菌株酿制的余甘子酒在香气成分的种类与含量上均存在一定差异，与Li 等[14]的研究结果一致，即酵母菌株对香气成分有显著的影响。5种酒样共鉴定了47种香气成分，醇类8种、酯类18种、醛酮类7种、酸类2种以及其它类12种，其中有21种是5 种酒样共有的，说明5 种酵母酿制的余甘子酒都拥有主体特征香气组分，同时也有其独有的香气成分，在种类和含量上存在一定的差异性，其中Perlage 酿制的酒样种类最丰富，EC1118 酿制的酒样香气总含量最高。5 种酒样醇类和酯类物质含量均较高，为余甘子酒的主要香气成分。

2.2.1 醇类 醇类物质是果酒中重要风味物质，如表3 所示，5 种余甘子酒中共检出8 种醇类物质，含量在332.72～523.41µg/L，EC1118 酿制的酒中醇类物质含量最高，说明EC1118 的产醇能力总体优于其余4 种酵母；异戊醇、2,3-丁二醇、苯乙醇在5 种酒样中均检出且含量较高，是余甘子酒主体香气成分之一。有研究表明，少量的高级醇能赋予果酒优雅的香气，使果酒香气更加完美[15]，如异戊醇有苹果白兰地香气和辛辣味，被认为是高级醇中最重要的挥发性物质[6]，苯乙醇有类似于玫瑰、紫罗兰、茉莉花等香味，少量的浓度就能产生很高的玫瑰香味，是果酒中主要的呈香物质之一[16]。5 种酒样中，D254 酿制的酒样中异戊醇含量最高，EC1118 酿制的酒样中苯乙醇含量最高。2,3-丁二醇是酒类中极少呈香的多元醇之一，主要呈现出淡雅细腻的玫瑰香气，EC1118 酿制的酒样中2,3-丁二醇含量显著高于其它4 种酒样（P<0.05）。

表3 不同酵母所发酵余甘子酒的挥发性香气成分Tab.3 Volatile aroma components ofPhyllanthuswines fermented by different yeastsµg·L-1

2.2.3 醛酮类 醛酮类化合物是一类产生令人愉快的水果香和花香的化合物[17]。在余甘子酒样中一共检测出7 种醛酮类物质，含量在11.93～34.13µg/L。苯甲醛和2,4-二甲基苯甲醛在5 种酒样中均有检出。苯甲醛具有甜杏仁、樱桃和坚果的风味，EC1118 酿制的余甘子酒中苯甲醛含量最高；2,4-二甲基苯甲醛具有樱桃、杏仁、香料和香草的风味，其含量在5 种酒样中差异不显著（P>0.05）。壬醛和癸醛是Perlage酿制的酒样特有，壬醛具有强烈的脂肪臭和果香香气，癸醛具有类似柠檬油的脂蜡状香气。

2.2.4 脂肪酸类 短链到中链脂肪酸如正己酸、正辛酸、癸酸的产量一般较低，这对果酒的芳香气味是积极的[20]。在5种酒样中仅检出2种脂肪酸，癸酸和辛酸，含量在10.43～38.37µg/L，癸酸在5种酒样中均有检出，辛酸仅在Aroma white、D254和Perlage酿制的酒样中检出。辛酸属于低级脂肪酸，具有明显奶酪和粗涩的味感，但却能平衡果酒的香气，抑制芳香酯的水解，对整体酒质结构具有重要作用[21]。

2.3 挥发性香气成分含量的主成分分析

为了能较准确的判别出不同酵母对余甘子酒中挥发性香气成分的影响，对5种酒样中共有的挥发性香气成分进行了主成分分析。其主成分的特征值及贡献率见表4。前3 个主成分的累积贡献率已经达到了87.05%，能基本反应酒中的挥发性香气成分的差异，其特征值均大于1，因此选用前3个主成分进行分析。

由图1 可知，不同酵母发酵所得余甘子酒中的挥发性香气成分之间存在一定差异，可以通过5 种酒样的前3 个主成分得分来区分不同酵母所发酵的余甘子酒，由于酵母Top15 和EC1118 发酵的余甘子酒的前3 主成分得分相近，因此将其归为1 类，而其余酵母发酵得到的余甘子酒前3主成分得分相差较大，因此各为1类，故5 种酵母发酵的余甘子酒通过香气成分可以分为4 类。图1 同时也表示47 种挥发性香气成分载荷图，因子的载荷系数越大表明该香气成分对主成分越重要。由此可以看出，橙花叔醇（0.963）、苯甲酸乙酯（0.967）、辛酸乙酯（0.908）、癸酸乙酯（0.980）、月桂酸乙酯（0.899）、邻苯二甲酸二丁酯（0.921）、9-十六碳烯酸乙酯（0.975）、壬醛（0.975）、葵醛（0.975）、苯乙烯（0.961）、顺-β-金合欢烯（0.975）、1-乙氧基戊烷（0.975）与第一主成分呈正相关；2,3-丁二醇（0.969）、癸酸（0.921）与第二主成分呈正相关，而丁二酸二乙酯（-0.839）与第二主成分呈负相关；十八烷（0.858）、正二十五烷（0.877）、二十烷（0.877）、十六烷（0.858）、十七烷（0.877）与第三主成分呈正相关，苯乙醇（-0.917）与第三主成分呈负相关。Perlage 酿制的余甘子酒第一成分得分最高，这是因其拥有最高的苯甲酸乙酯、辛酸乙酯，且9-十六碳烯酸乙酯、壬醛、葵醛、顺-β-金合欢烯、1-乙氧基戊烷是Perlage酿制的余甘子酒所特有的挥发性香气成分；EC1118 酿制的余甘子酒第二主成分得分最高，这与拥有最高的2,3-丁二醇、葵酸有关；D254酿制的余甘子酒第三主成分得分最高。

图1 挥发性香气成分的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of volatile aroma components

表4 主成分的特征值及贡献率Tab.4 characteristic values and contribution rates of principal components

2.4 酵母菌株对余甘子酒的感官评价

对5种不同酵母发酵所得余甘子酒进行感官评定，由表5可知，EC1118所酿制余甘子酒感官得分最高，为80.6分。Top15酿制的余甘子酒感官得分显著低于其它酒样（P<0.05）。

表5 不同酵母对余甘子酒感官得分的影响Tab.5 Effect of different yeasts on sensory scores ofPhyllanthuswines

2.5 模糊综合评判

由于感官评价有一定的主观性，不能准确地筛选出最佳的酵母菌株。将不同酵母酿制的余甘子酒的感官评分结合余甘子挥发性香气成分的质量浓度进行分析，利用模糊综合评判法优选出最适合余甘子酒的酵母菌株。

（1）建立判别对象集。U={U1,U2,U3,U4,U5}，其中：U1：Aroma white 酿制的酒样；U2：D254 酿制的酒样；U3：EC1118酿制的酒样；U4：Perlage酿制的酒样；U5：Top15酿制的酒样。

使用COMSOL软件进行多物理场耦合计算。采用四面体网格和边界层网格进行网格划分。网格独立性检验如下：对三分支微通道热沉的参数最大热应力σ进行检验，粗化网格、标准网格、细化网格的网格数量分别为105564、265365、422340，粗化网格与标准网格计算下的相对误差为0.42%，细化网格与标准网格计算下的相对误差为0.27%。综合考虑计算精度和计算时间，采用标准网格划分，如图3所示。

（2）建立评判因素集。由评判对象香气成分的分类，可以得出醇类和酯类化合物为主要因素，结合感官评价表建立判别因子集。

X={X1,X2,X3}，其中：X1：感官得分；X2：主要醇类化合物含量；X3：主要酯类化合物含量。

（3）建立评判因素集。根据表4构造感官评分因素的隶属度函数

由于余甘子酒的香气成分含量与酒品质呈正相关，故可构造线形上升的隶属函数。结合表3构造醇类、酯类隶属度函数表达式分别：

（4）建立权重集。经分析表明，酯类化合物较醇类化合物对果酒的呈香特征贡献大，再结合感官评价，根据德尔菲法[22]，确定判断中的权利分配：A={a1,a2,……an}={a1,a2,a3}={0.35,0.30,0.35}。其中（i=1,2,……n）。

（5）模糊综合评判计算。对Ui的每一因子利用U（Xi）进行模糊化，可得到X×U上的模糊关系距阵

用模糊线性变换，得到的评判结果为：

其中，模糊算子为M（×，⊕），结果归一化，得到

模糊综合评判的结果可表明酒样综合质量的优劣，从模型的结果可以得出发酵余甘子酒的酵母菌株优劣顺序依次为EC1118、Aroma white、Perlage、D254和Top15。这与感官评定的结果一致，表明利用该模型结合感官评分更具有客观性与说服力。

3 结论与讨论

酵母是酿造果酒的关键因素之一，不同酵母在糖酵解过程因其酶活的差异导致了代谢糖、酸、甘油及香气成分的差异[23]。郑娇等[13]研究了3 种不同酵母菌株对海红果酒的理化性质及香气成分进行了研究，结果表明酵母ICV254 的所得发酵酒的酒精度高、残糖量低、酸度低、感官评分好，同时香气成分多；李双石[24]研究了不同酵母对葡萄酒香气成分的影响，结果表明不同酵母发酵葡萄酒样中香气成分的种类和含量均具有明显差异。本研究通过对5 株酵母所酿制的余甘子酒的理化性质进行对比，Perlage 酵母的糖利用率低于其余4种酵母，EC1118酿制的酒样其酒精度适中，甲醇、挥发酸较低。通过GC-MS 对5 种余甘子酒的挥发性香气成分进行分析，共鉴定出47 种挥发性香气成分，主要为醇类与酯类物质。EC1118酿制的酒样总香气成分含量最高，为1 118.81µg/L。

主成分分析可以将错综复杂的关系变量归结为少数几个综合因子，其目的是为了简化数据和揭示变量间的关系[25]。目前该方法已经广泛地应用于果酒香气成分的分析中。黎星辰[26]、李凯[7]等采用主成分分析对分析不同商业酿酒酵母对果酒香气成分进行分析，均发现能有效地区分不同商业酵母。本试验采用主成分分析可将5种酿酒酵母有效的进行区分。经感官评价EC1118酿制的余甘子酒感官得分最高。将感官得分与挥发性香气成分结合进行模糊综合评判，得出5种酵母菌株酿制的余甘子酒的优劣顺序依次为EC1118、Aroma white、Perlage、D254和Top15，与感官得分结果一致。综合考虑，EC1118更适合作为酿制优质余甘子酒的发酵菌株。