酸性硅胶柱净化-气相色谱法测定禽肉中8种多溴联苯醚污染物含量

马仕豪，饶钦雄，张其才，王献礼，赵志辉，宋卫国*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403）

【研究意义】多溴联苯醚（polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）是溴代阻燃剂（brominated flame re⁃tardants，BFRs）的一种，常作为一种添加型阻燃剂被广泛地应用在电子、化工、建材、纺织、石油、采矿等领域[1]。目前商用的PBDEs 主要有五溴联苯醚、八溴联苯醚和十溴联苯醚，2001 年的全球需求量分别为7 500，3 790 和56 100 t[2-5]，十溴联苯醚（BDE-209）是目前世界上使用量最大的阻燃剂品种之一。如此大的使用量使得PBDEs 及代谢产物在多种环境介质中，如大气、土壤、水等环境介质及动植物体中均检出PBDEs，其中BDE-209 含量最高、分布最广，BDE-209 不仅具有内分泌毒性、免疫毒性以及肝脏毒性等，而且在环境或生物体内发生脱溴反应或转化生成毒性更高的BDE-47、BDE-99、BDE-153、BDE-183 等低溴代PBDEs 以及3-MeO-BDE47、5-MeO-BDE-47、6-MeO-BDE-47 等甲氧基多溴联苯醚，其通过食物链逐级放大，最后进入人体从而威胁到人类的健康[6-15]。2009 年5 月，《斯德哥尔摩公约》第4 次缔约方大会已将五溴联苯醚和八溴联苯醚列为新型持久性有机污染物［16］。BDE -209 目前虽未列入持久性有机污染物，但由于其可脱溴或转化为更毒化合物，其潜在的风险不可忽视，本文即以BDE-209 及其相关的降解产物为目标，研究建立PBDEs 在禽肉中的残留检测技术以应对风险评估研究的需求。【前人研究进展】目前国际上检测PBDEs 的标准方法主要是参考美国环保局（EPA）方法EPA 1614，该方法与EPA 1613 中二噁英的检测方法相似，利用多个层析柱进行净化处理。国内大部分学者多采用气相色谱法和气相色谱质谱法进行PBDEs 检测技术的研究[17-26]。李敏杰［17］利用凝胶渗透色谱（GPC）和固相萃取柱进行净化建立了GC-MS 检测鸡蛋中PBDEs 的方法；王景鑫［18］先以浓硫酸除脂净化再用GPC 进行2 次净化处理GC-MS 检测鸡饲料样品；沈梦楠[22]分析典型溴代阻燃剂（BDE-47）在鲫鱼体内与体外代谢时采用GPC 和硅胶柱净化。【本研究切入点】高分辨气相色谱-高分辨质谱仪（HRGC-HRMS）检测，方法净化过程繁琐，分析仪器昂贵，实验室条件要求高，一般实验室不具备该检测条件，不适宜广泛推广应用。【拟解决的关键问题】本文采用快速溶剂萃取法提取，结合浓硫酸和固相萃取柱净化的优点，制备酸性硅胶柱创新性的用于PBDEs 的净化，GC-ECD 检测，该方法更为经济和高效，适用于大量禽肉样品中PBDEs 的筛查。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备与试剂

仪器：高速粉碎机FW80（中国天津泰斯特仪器有限公司）；快速溶剂萃取仪ASE-300（美国戴安公司）；旋转蒸发仪R-300（瑞士Buchi）；涡旋混合器MX-S（中国东迈科技仪器有限公司）；氮吹仪NEVAP-112（美国Organomation）；气相色谱仪6890N（美国安捷伦公司），配电子捕获检测器（ECD）；破壁料理机JYL-C022E（中国九阳股份有限公司）；真空冷冻干燥机Pilot2-4LD（中国北京博医康实验仪器有限公司）。

试剂：正己烷、壬烷、二氯甲烷均为农残级，购于迪马科技有限公司；丙酮为农残级购自于上海安谱实验科技有限公司；硅胶（75～250µm）购于上海怀聪生物科技有限公司。

PBDEs标准溶液，包括2，2’，4，4’-四溴二苯醚（BDE-47，CAS：5436-43-1，50.0 mg/L；2，2’，4，4’，5-五溴二苯醚（BDE-99，CAS：60348-60-9，50.0 mg/L）；2，2’，4，4’，5，5’-六溴二苯醚（BDE-153，CAS：68631-49-2，50.0 mg/L）；2，2’，3，4’，4，5’，6’-七溴二苯醚（BDE-183，CAS：207122-16-5，50.0 mg/L）；十溴二苯醚（BDE-209，CAS：1163-19-5，50.0 mg/L）；3-甲氧基-2，2’，4，4’-四溴二苯醚（3-MeO-BDE-47，CAS：N/A，50.0 mg/L）；5-甲氧基-2，2’，4，4’-四溴二苯醚（5-MeO-BDE-47，CAS：N/A，50.0 mg/L）；6-甲氧基-2，2’，4，4’-四溴二苯醚（6-MeO-BDE-47，CAS：N/A，10.0 mg/L）均购自美国AccuStandard公司。混合标准工作液：将8种PBDEs的标准溶液用壬烷逐级稀释混合配制成1 mg/L的8种PBDEs的标准工作液并保存于-20ºC冰箱内，有效期6个月。

酸性硅胶柱的制备：取一定量100 目～200 目事先经550ºC 活化12 h并干燥保存的活性硅胶，将浓硫酸按照与硅胶质量比为11∶14 和3∶7 的比例逐滴与硅胶充分混合并振荡，直至获得均匀的混合物，分别制得44%酸性硅胶和30%酸性硅胶；取一定量无水硫酸钠660ºC 干燥不少于6 h 保存；于内径为15 mm的层析柱，依次装入1 g活性硅胶、10 g 44%酸性硅胶、2 g 30%酸性硅胶、2 g活性硅胶和6 g无水硫酸钠，干法装柱。

1.2 方法

1.2.1 试样制备 禽肉样品用破壁料理机搅拌成浆状，置于真空冷冻干燥机中于-20ºC、真空度为1 Pa条件下冷冻干燥72 h，再用高速粉碎机将样品打碎成粉末，置于-20ºC冰箱中保存。

1.2.2 提取 准确称取5.0 g试样于烧杯中，与10.0 g无水硫酸钠混合均匀，转移至加速溶剂萃取池中进行提取。提取条件为萃取溶剂，正己烷∶二氯甲烷=1∶1（v/v）；压力，10.3 MPa（1 500 psi）；温度，100ºC；加热时间，5 min；静态提取时间，8 min；吹扫时间120 s循环3次。样品提取液转移至平底烧瓶中，用少量正己烷分3次清洗接收瓶，并将提取液旋蒸浓缩至近干，加5 mL正己烷复溶，待净化。

1.2.3 净化 用30 mL 正己烷预淋洗酸性硅胶柱后，将待净化液加入柱中，并用3 mL 正己烷清洗3 次，清洗液一并加入柱中，当液面接近净化柱最上层，再用80 mL 正己烷∶二氯甲烷=1∶1（v/v）对酸性硅胶柱进行洗脱，收集上样液和洗脱液，旋蒸浓缩至3～5 mL转移至试管，3 mL正己烷清洗3次，氮气吹干，200µL壬烷复溶待测。

1.2.4 气相色谱条件 色谱柱：HP-5（30 m×320µm×0.25µm）。升温程序：初始柱温140 ℃，保持2 min；再以25 ℃/min 升至180 ℃，保持5 min；再以5 ℃/min 升至260 ℃，保持5 min；最后以15 ℃/min 升至310 ℃，保持10 min。载气为高纯氮气，流速为2 mL/min；检测器300 ℃；进样量1 µL，进样口温度：265 ℃。进样模式：不分流进样。

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

图1 优化升温程序前的色谱Fig.1 Chromatogram before optimizing the heating program

本研究初始气相条件参考由宗政等[23]的研究条件，初始柱温140ºC，保持1min；再以10 ℃/min 升至180 ℃，保持1 min；再以10 ℃/min升至260 ℃，保持2 min；最后以25 ℃/min升至310 ℃，保持10 min，结果5-MeO-BDE47 和6-MeO-BDE-47 没有有效分离，见图1，这是由于化合物性质相似，出峰时间相近造成的。然而8 种PBDEs 的沸点为310～425 ℃，由于BDE-209 的沸点较低，高温下易降解，因此进样口温度设置为265 ℃，最高柱温设置为310 ℃，这样既可以防止PBDEs 在进样口处的分解，又可以防止其在色谱柱内的分解。最后本研究通过调整升温程序，最后在1.2.4 的气相色谱条件下，8 种多溴联苯醚均获得了有效的分离，并获得较好的仪器相应值，但是BDE-209 的响应值较其他化合物依然要低很多，详见图2。

图2 优化升温程序后的色谱Fig.2 Chromatogram after optimizing the heating program

2.2 酸性硅胶柱洗脱条件优化

在PBDEs的检测方法中，生物样品中的大量油脂和杂质主要是通过浓硫酸、GPC和固相萃取柱来去除。样品中直接添加浓硫酸，除脂能力最强，但其可能会引起化合物的不稳定，且操作较为危险；GPC 除脂效果显著，但是除脂能力有限，普通净化柱只能去除0.5 g左右脂肪，超过这个脂肪量则会引起柱堵塞；固相萃取小柱重现性好且适合批量生产，但是普通规格的小柱除脂能力较难达到本研究的要求。因此本文结合浓硫酸和固相萃取柱的优点，参考EPA 1614的复合硅胶柱的制作方法，制成酸性硅胶柱，为达到最佳的净化效果，本文对酸性硅胶柱的洗脱条件进行了摸索。

图3 8 种PBDEs的洗脱结果Fig.3 Elution results of eight PBDEs

以标准品配制含100 µg/L 的8 种多溴联苯醚的提取液上净化柱，选用正己烷和正己烷∶二氯甲烷（1∶1，v/v）作为洗脱溶剂，分段收集洗脱液，每段收集20 mL，测定洗脱液，结果见图3。

结果采用正己烷洗脱时，80 mL 能将BDE-47、BDE-99、BDE-153、BDE-183 基本洗脱下来，但MeO-BDE 由于极性较弱无法洗脱，而以以正己烷∶二氯甲烷（1∶1）作为洗脱溶剂，60 mL 能够基本洗脱，80 mL 可以完全洗脱，因此本研究确定以正己烷∶二氯甲烷（1∶1）作为方法的洗脱溶剂，洗脱体积为80 mL。

2.3 线性关系、检出限和定量限

移取1 mg/L 的PBDEs 混合标液，壬烷逐级稀释，配制质量浓度分别为0.5，1，2，20，50，100，200，500 µg/L 的PBDEs 标准工作液，气相色谱进行检测，标准品色谱图见图2，以横坐标作为质量浓度，纵坐标作为响应峰面积，作标准曲线，8种PBDEs具有良好的线性关系，结果见表1。

采用优化的前处理方法和仪器条件，进行一系列低水平加标回收试验，以3 倍和10 倍信噪比（S/N）来确定检出限（LOD）和定量限（LOQ），结果，BDE-209 的检出限（LOD）为0.125µg/kg 其余7 种PBDEs 的检出限为0.025 µg/kg；BDE-209 的定量限（LOQ）为0.4 µg/kg 其余7 种PBDEs 的定量限为0.1 µg/kg。目前国内外尚未规定食品中PBDEs 的限量标准，但EPA 规定商用十溴联苯醚每日可摄入计量为10µg/kg；商用八溴联苯醚每日可摄入计量为3µg/kg；商用五溴联苯醚每日可摄入计量为2µg/kg，按照可摄入量计量要求，本方法的检出限应能满足PBDEs 的检测要求。且与一些相关的研究报道相比较，例如李敏洁[17]检测鸡蛋中的BDE-47、BDE-99、BDE-153、BDE-183、6-MeO-BDE-47 检出限为0.02～0.05µg/kg；王景鑫[18]建立了饲料中检测BDE-47 的方法，检出限为0.11 µg/kg；王旭亮[21]建立了猪肝中的检测方法BDE-47 的检出限为0.081 µg/kg，BDE-153 的方法检出限为0.110 µg/kg；沈梦楠[22]建立了鲫鱼内检测BDE-47 的方法检出限为0.25µg/kg。本方法的灵敏度与报道的方法相当，但本方法只需要通过酸性硅胶柱净化浓缩后即可上机检测，更加的简单实用。

表1 8种PBDEs的线性方程、相关系数、线性范围、方法检出限和定量限Tab.1 Linear equations，correlation coefficients，linear ranges，and method detection limits of 8 PBDEs

2.4 准确度和精密度

以空白鸡肉样品为代表进行添加回收实验，设置方法定量限以及1.0µg/kg 和10.0µg/kg 3 个水平，每个水平重复5次，同时设置空白对照，按照本研究建立的前处理方法和仪器方法进行检测，用基质标定量，计算回收率和精密度（RSD）。添加回收结果见表2。

从表2中可以看出8种PBDEs在鸡肉中的平均加标回收率为66.0%～146.7%，相对标准偏差为2.8%～11.4%。本方法的准确度满足EPA1614[27]方法中PBDEs 的回收率为50%～150%的要求，方法的精密度也满足GB/T 27404的要求，证实该方法可以满足禽肉中8种PBDEs的定量检测要求。

表2 鸡肉中8种PBDEs的平均加标回收率和精密度Tab.2 The average recoveries and RSDs of 8 PBDEs in chicken

3 结论与讨论

本文通过对仪器条件和前处理净化条件的研究，建立了禽肉中8种多溴联苯醚的气相色谱定量检测方法。加标回收实验表明本方法的检出限为0.025～0.125µg/kg，定量限为0.1～0.4µg/kg，方法的准确度和精密度均能满足残留检测的要求。目前国内学者也进行了PBDEs 的研究，李敏杰[17]、王景鑫[18]、王旭亮[21]、沈梦楠[22]等学者分别建立了鸡蛋、饲料鱼肉、猪肝中PBDEs 的前处理技术，采用GPC 净化后结合固相萃取柱等方法净化，但GPC 只能处理单个样品，因此效率较低，且消耗试剂量较大。本研究对前处理进行了创新改进，参考EPA 1614 的复合硅胶柱的制作方法，制成酸性硅胶柱，为达到最佳的净化效果，确定以正己烷∶二氯甲烷（1∶1）作为洗脱溶剂，洗脱体积为80 mL。本研究仅用酸性硅胶柱净化浓缩即可分析检测，同时处理多个样品，方法效率高且环保。本实验采用许多分析实验室均有的气相色谱仪进行定量检测，使得方法更具有适用性，克服了高分辨气相色谱-高分辨质谱仪（HRGC-HRMS）方法净化过程繁琐、分析仪器昂贵的缺点，为多溴联苯醚研究提供了更为实用的检测手段，适合于大批量禽肉样品中PBDEs 的筛查和相对高含量样本的检测。然而本实验仅研究了禽肉样品中PBDEs 的检测方法，对于其它非禽肉样品中PBDEs的分析检测仍需要进一步的研究。

致谢：上海市农业科学院宋卫国和饶钦雄老师以及持久性有机污染物研究科室的工作人员在试验和文章上提出了宝贵意见，谨致谢意！