RTX去除TRPV1+感觉神经对C57BL/6J小鼠毛发颜色及生长的影响

刘庶慈，徐溪悦，汤安群，刘 丹，郑骏年，施 明

(徐州医科大学肿瘤防治研究所,江苏 徐州 221000)

毛发颜色及生长能力受多种因素影响，包括基因、年龄、营养、药物、精神心理因素等[1-2]。尽管最近的研究显示，毛囊中的多种结构，如毛囊干细胞[3-4]、血管[5]和神经[6-7]等均可以影响毛发色素沉着和生长能力，但伤害感觉神经在其中的作用鲜有报道。《黄帝内经》中有“一日三篦，发须稠密”的理论，传统医学将其解释为梳齿刺激头部穴位、疏通十二经脉，从而起到滋养毛发的作用。但从现代医学角度，梳齿刺激头皮的伤害感觉神经与促进毛发生长之间是否有关联仍有待研究。

伤害感觉神经中有一类重要的神经是香草酸瞬时受体亚型Ⅰ(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)阳性感觉神经，这类神经由于表达TRPV1通道蛋白，可以被热、炎症和化学刺激激活，介导疼痛或瘙痒的产生[8-9]。树胶脂毒素(resiniferatoxin，RTX)是TRPV1的高亲和力配体，大剂量的RTX可以通过开放TRPV1离子通道，使Ca2+大量进入细胞内，引起细胞损伤，从而破坏表达TRPV1的感觉神经元。本研究利用RTX去除小鼠TRPV1+感觉神经，研究其对小鼠毛发变白及再生能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物本研究应用SPF级4周龄♀C57BL/6J小鼠和Balb/c小鼠各10只，体质量(13±1)g，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0006]，所有小鼠饲养于徐州医科大学实验动物中心[SYXK(苏)2016-0028]，12 h昼夜交替，温度控制在(24±1)℃，自由饮食。实验动物的处理符合福利伦理要求。本实验遵照动物实验使用的3R(减少、替代、优化)原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器RTX(批号AI27)购于爱必信(上海)生物科技有限公司；Tween 80(批号WXBC2717V)购于Sigma-Aldrich公司；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)(批号VC2001P)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(批号1209M036)均购于微科曼得生物工程有限公司。BME-480型热板测痛仪购于上海玉研科学仪器有限公司；HH-S1型恒温水浴锅购于巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1消融小鼠体内TRPV1+感觉神经 RTX可用于化学法消融小鼠TRPV1+神经[8,10]。4周龄小鼠连续3 d注射递增剂量的RTX(30、70、100 μg·kg-1)，RTX溶解于含有体积分数为2%的DMSO和体积分数为0.15%的Tween 80的PBS中，注射方式为小鼠前肢腋下皮下注射。对照组小鼠皮下注射等体积溶剂。RTX注射4周后，进行甩尾实验和热板实验(Fig 1A)。甩尾实验和热板实验反映小鼠对热刺激的敏感度，可评估TRPV1+感觉神经去除效果。将小鼠处于垂直放松状态，鼠尾浸入52 ℃水浴中，记录小鼠甩尾反应出现的潜伏时间，最长不超过60 s(Fig 1B)。热板实验是将小鼠置于52 ℃的热板测痛仪上，记录小鼠从开始受到热刺激到对热刺激做出相应反应(如抬起或舔舐后爪)的时间，最长不超过120 s。小鼠对热刺激敏感性显著降低，说明成功建立去除TRPV1+感觉神经的小鼠模型[11]。

2 结果

2.1 RTX介导化学性消融小鼠TRPV1+感觉神经4周龄的C57和Balb/c小鼠随机分为RTX处理组和溶剂处理组，每组各5只。RTX组连续3 d皮下注射RTX，溶剂处理组皮下注射等体积的溶剂。4周后进行甩尾实验和热板实验。在C57小鼠的甩尾实验中，RTX处理组小鼠的甩尾反应潜伏时间平均值为58.8 s，而溶剂处理组小鼠为2.6 s，差异具有统计学意义(P<0.01)。在C57小鼠的热板实验中，RTX处理组小鼠的热反应潜伏时间平均值为111.8 s，而溶剂处理组小鼠为38.4 s，差异具有统计学意义(P<0.01)。Balb/c小鼠的甩尾实验和热板实验获得类似结果，RTX处理组小鼠比溶剂处理组的小鼠对热刺激做出反应的潜伏时间明显延长，两组间差异具有统计学意义(P<0.01，Fig 1C)。这些结果说明已经成功建立了去除TRPV1+感觉神经的小鼠模型。

Fig 1 RTX-mediated chemical ablationA: Schematic representation of RTX administration; B: Diagram of tail-flick assay; C: Tail-flick assay and hot-plate test results of C57 mice and Balb/c mice: C57-T: tail-flick assay of C57 mice; C57-H: hot-plate test of C57 mice; Balb/c-T: tail-flick assay of Balb/c mice; Balb/c-H: hot-plate test of Balb/c mice. **P<0.01 vs vehicle.

2.2 RTX消融C57小鼠TRPV1+神经导致特定部位毛发脱落及白化RTX处理C57小鼠4周后， C57小鼠局部毛发变白(Fig 2A)，而溶剂对照组小鼠毛发颜色未见变化。为了探究毛发变白的发生过程，同时验证所观察到现象的稳定性，重复上述实验，并连续观察小鼠毛发变化情况。结果发现在RTX皮下注射7 d后，RTX处理的C57小鼠颈部开始出现毛发脱落及局部皮肤破损。在d 11时，RTX组小鼠颈部的皮肤破损愈合，但背部特定区域出现毛发脱落。在d 14时，小鼠脱毛部位开始有新毛发长出。在d 18时，脱毛部位均长出新的毛发，但新生毛发呈白色(Fig 2B)。溶剂对照组的C57小鼠毛发一直未见变化。然而用RTX处理Balb/c小鼠并持续观察，并未发现毛发脱落现象(Fig 2C)。因Balb/c小鼠毛发为白色，无法在本实验中观察去除TRPV1+感觉神经对Balb/c小鼠毛发颜色的影响。

2.3 RTX消融C57小鼠TRPV1+神经促进毛发再生RTX处理组的C57小鼠在局部毛色变白前出现毛发脱落的现象(Fig 2B)。为观察化学法消融TRPV1+感觉神经对C57小鼠毛发再生的影响，在小鼠注射RTX 4周后剃除实验组和对照组小鼠的毛发，观察小鼠毛发再生情况。剃除毛发18 d后，RTX处理组小鼠毛发重新长出，背部特定部位的毛发为白色。而溶剂对照组小鼠在剃毛后18 d，毛发尚未完全长出(Fig 3)。这些结果提示RTX去除C57小鼠TRPV1+感觉神经不仅可以使小鼠出现特定部位的毛发变白，而且可以加快毛发的再生速度。

Fig 2 Hair shedding and graying at certain parts resulted from ablating TRPV1+ nerves of C57 miceA: Representative images of C57 mice after subcutaneous RTX injection; B: Representative images of C57 mice continuously investigated after RTX treatment; C: Representative images of Balb/c mice continuously investigated after RTX treatment.

Fig 3 Hair regeneration promoted by ablating TRPV1+ nerves of C57 miceC57 mice were treated with RTX or vehicle. After 4 weeks，the back hair of the mice was shaved，then the regeneration of hair was recorded after 18 days. Here are the representative images.

3 讨论

神经和毛发之间的关系在很早以前就被人们认识到，自古就有“一夜愁白头”的说法，但相关机制尚不完全清楚。有研究证明，皮肤神经对毛囊和毛发生长有营养和调控作用。1995年，Asada-Kubota[12]报道了化学法消融交感神经抑制新生小鼠毛发的生长。1999年，Botchkarev等[7]揭示了肾上腺素能神经可以调节毛发周期，进而影响毛发生长。2018年，Fan等[13]的研究显示外部光线刺激眼睛可以通过激活交感神经，释放去甲肾上腺素，进而激活毛囊干细胞，促进毛发再生。这些研究主要关注自主神经对毛发生长的影响，而关于感觉神经对毛发变白的影响尚未见报道。

本研究发现，RTX消融C57小鼠的TRPV1+感觉神经后，小鼠毛发出现局部脱落，新生毛发变白的现象。而且多次重复实验的结果显示，毛发脱落及毛色变白仅出现在小鼠的脊柱及坐骨神经体表投影附近，而该区域正是伤害感觉神经初级传入纤维及神经元胞体所在部位。所以，我们推测C57小鼠皮下注射RTX引起的局部毛发脱落及毛色变白的现象有可能是因为消融了TRPV1+感觉神经,使该神经富集部位毛囊萎缩，进而出现毛发脱落和新生毛发变白。有研究报道，TRPV1的激活可以抑制人头发生长[14]，这与本研究中发现的RTX组小鼠剃毛后毛发再生速度快于对照组小鼠可以相互印证。但这些现象仅在RTX处理的C57小鼠中出现，在RTX处理的Balb/c小鼠模型中未观察到毛发脱落的现象，这可能与这两种小鼠间存在的基因差别有关，具体机制仍需进一步探索。此外，虽然RTX对TRPV1+感觉神经有高选择性，对其他神经无明显作用，但仍不能排除RTX药物本身对于实验结果的影响，因此，还需要从基因水平去除C57小鼠的TRPV1+感觉神经，进一步验证上述结论。

本研究揭示了RTX去除TRPV1+感觉神经可以引起C57小鼠特定区域毛发脱落，新生毛发变白，同时毛发再生速度加快，提示伤害感觉神经与毛发生长及毛发变白有关。相关机制有待进一步深入研究。