miR-21、miR-204、miR-34a联合检测在胃癌临床诊断中的价值

吴海玲 袁冲

作者单位：710032 西安 空军军医大学第一附属医院检验科

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，在我国发病率位居所有恶性肿瘤第二位，死亡率居第三位［1-2］。胃癌早期症状不明显，据统计我国胃癌早期诊断率仅为20%，而确诊时病期较晚是导致胃癌患者预后不良的重要原因［2-3］。因此，早期筛查、早期发现是有效改善预后的重要手段。临床上常用于胃癌早期筛查的肿瘤标志物，如 CA199、CA72-4、CA125、AFP 和 CEA 等敏感度和特异度仍不理想［2，4］。MicroRNA（miRNA）是一类高度保守的非编码小RNA，由20～24 nt组成，研究证实多种 miRNA在恶性肿瘤包括胃癌中异常表达，且可发挥促癌或抑癌双重作用［5-6］。有研究报道miR-21、miR-204和miR-34a在胃癌患者和正常健康人群中的表达水平差异显著［7-9］。但是miRNA对胃癌的诊断价值仍未知，也缺乏有效筛查早期胃癌的miRNA分子。本研究采用实时荧光定量PCR检测胃癌患者、胃部良性病变患者和健康志愿者血清中miR-21、miR-204和miR-34a的表达水平并评估各指标单独及联合检测的诊断效能，以期为胃癌诊断提供新的指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年2月至2018年1月于空军军医大学第一附属医院就诊的42例胃癌患者（胃癌组）、22例胃部良性病变患者（良性病变组）的血清标本，以及同期于本院进行健康体检且体检报告正常的25名健康志愿者（健康对照组）的血清标本。胃癌患者纳入标准：⑴经胃镜及术后病理组织学检查确诊为胃癌；⑵初治，既往无胃部手术史；⑶采血前未进行任何抗肿瘤治疗。排除标准：⑴肝、肾和心脏功能严重损害；⑵有高血压发病史（收缩压＞140 mmHg，或舒张压＞90 mmHg）；⑶合并其他恶性肿瘤。42例胃癌患者中男性24例，年龄 38～72 岁，平均（55.1±8.0）岁；22例胃部良性病变患者中男性 13 例，年龄 32～68 岁，平均（54.8±7.0）岁；其中胃息肉9例，慢性浅表性胃炎13例。25名健康志愿者中男性13名，年龄 28～66岁，平均（52.6±9.2）岁。3组年龄、性别等差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经空军军医大学第一附属医院伦理委员会批准，研究对象知情同意。

1.2 实时荧光定量PCR检测血清miR-21、miR-204和miR-34a的表达水平

抽取空腹肘静脉血5 mL，离心后取上清液，-80℃冰箱保存备用。参照Trizol试剂（美国Invitrogen公司）说明书提取RNA，用分光光度计检测RNA浓度及纯度。参照All-in-OneTMmiRNA第一条链cDNA合成试剂盒（美国GeneCopoeia公司）说明书合成cDNA，然后用All-in-OneTMmiRNA qPCR试剂盒检测miR-21、miR-204和miR-34a的表达水平。扩增条件：95℃预变性 10 min；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火 10 s，72 ℃延伸20 s，扩增40个循环；最后72℃延伸10 min，熔解曲线条件按照自动程序进行。U6、miR-21、miR-204和miR-34a上游引物由上海生工生物工程有限公司合成，下游通用引物由GeneCopoiea公司提供。以U6基因为内参，用2-△Ct计算目的基因的相对表达水平。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 6.0和SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量数据采用均数±标准差（±s）表示。使用独立样本t检验比较两组间的计量数据，多组间均数的比较采用单因素方差分析，多重比较用Scheffe检验。使用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线及其曲线下面积（area under the curve，AUC）评估血清miRNA对胃癌的诊断能力。通过logistic回归求得联合预测因子，构建胃癌诊断模型。使用Z检验比较曲线下面积。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-21、miR-204、miR-34a在胃癌患者血清中的表达水平

实时荧光定量PCR检测结果显示，胃癌组、良性病变组和健康对照组中miR-21、miR-204、miR-34a的表达水平组间比较差异均有统计学意义（F=10.330，P<0.001；F=13.750，P<0.001；F=5.964，P<0.001），其中miR-21在胃癌组患者血清中的表达水平高于良性病变组和健康对照组（均P<0.01）；而miR-204和miR-34a表达水平低于其余两组（均P<0.01）；健康对照组和良性病变组患者中3个指标的表达水平差异均无统计学意义（均P>0.05）。见图1。

进一步分析13例早期胃癌患者（Ⅰ期、Ⅱ期），结果显示，miR-21在早期胃癌患者血清中的表达水平高于健康对照组和良性病变组（均P<0.05），而miR-204和miR-34a表达水平均低于其余两组（均P<0.05），见图 2。

2.2 miR-21、miR-204、miR-34a表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系

胃癌患者血清中miR-204的表达水平与远处转移有关（P=0.048），miR-21、miR-204、miR-34a 与胃癌患者年龄、性别、TNM分期、病理类型等临床病理特征均无关（P＞0.05），见表 1。

2.3 miR-21、miR-204、miR-34a对胃癌的诊断效能

ROC曲线结果显示，miR-21、miR-204及miR-34a诊断胃癌的最佳截断值分别为0.026、0.010、0.002，AUC分别为0.736、0.724、0.654。经logistic分析得出联合预测因子，联合预测因子=0.562+13.092×miR-21-55.045×miR-204-74.240×miR-34a。联合检测血清miR-21、miR-204和miR-34a诊断胃癌的最佳截断值为 0.502，AUC 为 0.849，明显高于 miR-21（P=0.047）、miR-204（P=0.029）和 miR-34a（P=0.038）单独诊断胃癌的AUC，见表2和图3。

图1 miR-21、miR-204、miR-34a在胃癌患者血清中的表达水平■Fig.1 Expression of miR-21,miR-204,miR-34a in the serum of patients with gastric cancer

图2 miR-21、miR-204和miR-34a在早期胃癌患者血清中的表达水平Fig.2 The expression of miR-21,miR-204 and miR-34a in the serum of patients with early gastric cancer

表1 miR-21、miR-204、miR-34a表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between the expression of miR-21,miR-204,miR-34a and clinicopathological characteristics in GC patients

表2 miR-21、miR-204及miR-34a对胃癌的诊断价值Tab.2 Diagnostic value of miR-21,miR-204 and miR-34a in gastric cancer

图3 miR-21、miR-204和miR-34a对胃癌的诊断效能Fig.3 Diagnostic efficiency of serum miR-21,miR-204 and miR-34a in gastric cancer

2.4 miR-21、miR-204、miR-34a 对早期胃癌的诊断效能

ROC曲线结果显示，miR-21、miR-204及miR-34a诊断早期胃癌的最佳截断值分别为0.036、0.008、0.002，AUC 分别为 0.717、0.691、0.611。经 logistic分析得出联合预测因子，联合预测因子=-1.000+12.044×miR-21-48.623×miR-204-25.282×miR-34a。联合检测血清miR-21、miR-204和miR-34a诊断早期胃癌的最佳截断值为0.359，AUC为0.828，明显高于miR-21（P=0.039）、miR-204（P=0.042）和 miR-34a（P=0.026）单独诊断早期胃癌的AUC。见表3和图4。

表3 miR-21、miR-204及miR-34a对早期胃癌的诊断价值Tab.3 Diagnostic value of miR-21,miR-204 and miR-34a in early gastric cancer

图4 miR-21、miR-204和miR-34a对早期胃癌的诊断效能Fig.4 Diagnostic efficiency of serum miR-21,miR-204 and miR-34a in early gastric cancer

3 讨论

目前临床常用的胃癌诊断方法有影像学检查、超声、内窥镜、病理组织活检等，但均有一定局限性，近年来研究发现肿瘤标志物对胃癌诊断也具有一定价值［2-3］。miRNA主要在动植物中参与转录后的基因表达调控，以单拷贝、多拷贝或基因簇等形式存在于基因组中，且可通过调控细胞生存、细胞分化、细胞运动等过程参与细胞内的多种生命活动［5］。既往研究显示miRNAs在胃癌诊断中具有一定潜力。其中miR-21在胃癌组织和胃癌患者外周血中呈高表达［7，10］，在不同研究中诊断胃癌的 AUC 分别为 0.86［11］和 0.91［12］。在消化系统恶性肿瘤中miR-21诊断的AUC为0.87，敏感度为0.76，特异度为 0.84［13］。而 miR-204在胃癌组织和胃癌患者外周血中则表现为低表达，且与患者的临床分期及远处转移有关［8，14］，诊断晚期胃癌的敏感度为0.73，特异度为0.60［15］。miR-34a也在胃癌组织中低表达［9，16］，同时与淋巴结转移、TNM 分期、肿瘤分化、肿瘤高复发率和5年生存期缩短有关［17］。KIPKEEVA等［18］报道，miR-34在已经发生淋巴结转移和远处转移的胃癌组织中低表达，且诊断已发生转移胃癌的AUC＞0.9。本研究检测 miR-21、miR-204 和 miR-34a在胃癌患者血清中的表达，发现miR-21表达水平升高，而miR-204和miR-34a表达水平降低，与上述研究结果一致。但是在诊断方面，miR-21、miR-204和miR-34a诊断胃癌的AUC（分别为0.736、0.724和0.654）及诊断早期胃癌的 AUC（为0.717、0.691、0.611）均低于上述研究，分析原因可能与病例的纳入标准、病例数以及方法不同有关，提示血清miR-204、miR-34a和miR-21单独诊断胃癌具有一定的临床意义，但是效能并不高。

近年来研究显示，联合检测血清miRNAs可提高胃癌早期诊断价值［3，19］。目前临床上常联合检测CEA、CA-19-9和CA72-4等指标辅助胃癌诊断，但敏感度和特异度仍不理想［4］。多项研究表明联合检测血清miRNAs可能是胃癌一种有效的诊断方法。许超等［20］报道，联合检测miR-148a和miR-106a诊断胃癌的AUC为0.844。徐雪等［21］研究也发现，胃低级别上皮内瘤变与胃高级别上皮内瘤变（早期胃癌）患者外周血中miRNA-106b和miRNA-27a的含量差异明显，可能是潜在的早期癌变诊断分子标志物。本研究也发现，联合检测miR-21、miR-204和miR-34a诊断胃癌的AUC为0.849，联合诊断早期胃癌的AUC为0.828，提示三项指标联合检测可明显提高诊断效能，在胃癌早期诊断中具有良好的临床意义。

综上所述，本研究发现miR-21、miR-204和miR-34a在胃癌患者血清中差异表达，但是单独诊断胃癌的效能并不理想，联合检测血清可以提高诊断效能，有效辅助诊断胃癌，但本研究样本量有限，结论尚需进一步验证。