HPV E6 /E7 mRNA联合TCT检测在子宫颈癌早期筛查中的应用

沈 倩 杜 军

子宫颈癌（CC）是女性最常见的生殖系统恶性肿瘤，报道显示每年全球约有23万女性死于CC，在导致女性死亡的恶性肿瘤中排第四位，并且发病呈年轻化趋势[1-2]。现已证实高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染是CC发病的主要原因，因此，对适龄女性的HPV筛查是防治CC的重要措施。目前我国主要采用液基细胞学（Thinprep Cytologic Test，TCT）联 合HPV DNA检测 作CC筛查方案。但HPV感染大多是一过性，会在数年之内自发转阴[3]。因此，阳性结果仅能够说明有HPV的感染，而对于CC的诊疗意义有限。最近的研究表明持续性的HPV感染可以上调病毒中的E6/E7蛋白表达，而后者可以通过抑制细胞凋亡以及影响细胞周期使细胞永生化[4]。因此本研究旨在评估TCT联合HPV E6/E7 mRNA在CC初筛中的应用价值。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年11月-2020年5月中国科技大学附属第一医院（安徽省立医院）妇科门诊及住院患者163例，于病理科收集其宫颈脱落细胞标本（均为1周内标本，4 ℃保存），患者年龄22～69岁，平均年龄（45±11）岁。纳入标准：有性生活史，无宫颈手术史，无妇科肿瘤病史及家族史，非月经期、妊娠期、哺乳期，就诊前24 h无性生活、阴道操作、阴道用药、应用阴道避孕用品或阴道洗剂。

1.2 方法

1.2.1 TCT 利用LBP制片仪制片，95%乙醇固定30 min、巴氏染色、封片、干片。由2位细胞学医师依据2001年国际癌症协会推荐的（TBS）分类标准进行阅片判读，将TCT检查结果分为未见上皮内病变或恶性病变（NILM）、非典型鳞状上皮细胞（ASC）、低级别鳞状上皮内病变（LSIL）、高级别鳞状上皮内病变（HSIL）、鳞状细胞癌（SCC）。其中ASC包括无明确诊断意义的非典型鳞状细胞（ASCUS）和不能排除高级别鳞状上皮细胞内病变非典型鳞状细胞（ASC-H）。不低于ASCUS被认定为阳性结果，NILM被认定为阴性结果。

1.2.2 HPV E6/E7 mRNA 采用Branch－DNA法测定HPV E6/E7 mRNA，3 000 r/min离心5 min，弃上清液，蒸馏水清洗，再次离心弃上清液，加入蛋白酶K 3μL+裂解液300 μL，吹打、混合均匀，恒温箱（65 ℃）孵育30 min，终止反应，采用宫颈稳态试剂盒（Kodia，郑州）检测HPV E6/E7 mRNA表达情况，严格参照试剂使用说明进行操作，反应板放入冷光仪，自动计算HPV E6/E7 mRNA拷贝数值（Copies），重复测定3次，取均值，以平均拷贝数＞1.0视为阳性。

1.2.3 组织病理检查 阴道镜检查前3天禁止性生活及妇科检查，急性宫颈炎及阴道炎先行适当治疗，阴道镜检查及活检指征参考中国子宫颈癌筛查及异常管理相关问题专家共识。活检组织送病理科进行组织病理学检查，由两位主治以上级别病理科医师制片阅片，按WHO女性生殖器肿瘤分类（2014）建议采用二级分类法（即LSIL和HSIL）描述子宫颈鳞状上皮内病变，将结果分为正常/炎症组、LSIL组、HSIL组及浸润鳞状细胞癌组，以病理检查结果为金标准。

2 结 果

2.1 TCT以及组织病理学检测结果 163例样本TCT检测结果中，阴性（NILM）58例（35.58%），阳性共105例（64.42%），其中ASC、LSIL和HSIL分别为71例（43.56%）、14例（8.59%）和20例（12.27%）。组织病理学检测显示正常/炎症、LSIL、HSIL和浸润癌分别为43例（26.38%）、56例（34.36%）、53例（32.52%）和11例（6.75%），见表1。

表1 TCT检查结果及组织病理学结果 例(%)

2.2 HPV E6/E7 mRNA检测结果 163例样本HPV E6/E7 mRNA检测结果中，阴性37例（22.70%），阳性126例（77.30%），阳性结果在病理组织学正常/炎症组、LSIL组、HSIL组和浸润癌组中分别为17例（39.53%）、51例（91.07%）、50例（94.34%）和8例（72.73%）。见表2。

表2 HPV E6/E7 mRNA检查结果以及组织病理学结果

2.3 单一检测和联合检测的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值 TCT检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为78.33%、74.42%、89.52%和55.17%。HPV E6/E7 mRNA检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为90.83%、60.47%、86.51%和70.27%。两者联合检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为96.88%、67.65%、83.58%和87.49%，明显优于单独检测结果，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 单一检测和联合检测的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值

3 讨 论

CC发病率仅次于乳腺癌，是女性常见恶性肿瘤之一。研究报道，HPV持续感染是CC及其癌前病变发生发展的必要条件，因此检测HPV DNA的持续感染能有助于CC及其癌前病变的早期诊断和治疗[1-2]。但多数患者HPV感染呈一过性，而呈 HPV 持续感染患者宫颈上皮细胞发生恶化前通常经历5～10年的癌前病变阶段，因此HPV DNA检测对宫颈疾病恶化风险预测效果可能不理想[5]。另一方面，HPV基因组包括两类编码基因区，即7个早期区（E1、E2、E4、E5、E6、E7和E8）基因和2个晚期区（L1和L2） 基因，其中由E6/E7基因编码的致癌蛋白是导致宫颈上皮癌变的重要因子。HPV DNA整合于宿主染色体脆弱区，破坏编码特异性DNA束缚蛋白的E2区，引起E6和E7两种癌基因的过表达，通过抑制抑癌基因功能、激活端粒酶活性等机制，最终导致细胞周期失控、永生化成为癌细胞[6]。研究提示，宫颈组织中HPV E6/E7 mRNA表现出癌基因活性，对于持续HPV感染患者，HPV E6/E7 mRNA异常表达往往预示着细胞恶化风险增高[7]。因此，HPV E6/E7 mRNA检测可用于早期筛查CC。

HPV E6/E7 mRNA检测的基本原理是利用支链DNA信号放大技术将靶信号放大，然后对E6/E7进行半定量分析。宫颈脱落细胞中检出HPV E6/E7 mRNA提示HPV处于活动状态，可翻译致癌蛋白即E6/E7蛋白。有学者发现，E6蛋白可与p53蛋白结合，与泛素连接酶组成三聚体复合物，降低p53蛋白抑癌作用。而E7蛋白则可调控Rb家族及细胞周期调控蛋白，促进细胞无限增殖，诱发癌变。且E6、E7两者具有协同作用，可强化细胞转化能力，引起细胞增殖，导致CC发病[8]。Frank等[9]研究表明，随CC病变程度的上升，HPV E6/E7 mRNA表达逐渐上升，认为HPV E6/E7 mRNA与CC临床分期呈正相关关系，可将其作为致癌风险评估的依据。本研究将阴道镜下活检作为金标准，对同时完成TCT、HPV E6/E7 mRNA检查及病理活检的163例受检者的临床资料进行回顾性分析，结果发现，随病理分级及TCT分级的上升，患者HPV E6/E7 mRNA 阳性率及定量值上升，与Macedo等[10]研究结论一致，表明HPV E6/E7 mRNA的变化与宫颈病变程度有关。此外，进行诊断效能分析发现，HPV E6/E7 mRNA 诊断敏感度高于TCT，而特异性低于TCT，且两者联合筛查的各项指标均优于单项筛查，提示两者联合诊断可综合HPV E6/E7 mRNA与TCT 的优势，提高诊断敏感度及特异性，为早期CC的检出提供依据。

综上所述，本研究将分子生物学技术与细胞学相结合用于CC的早期诊断，证实了TCT、HPV E6/E7 mRNA两者联合检测有较高的敏感度与阴性预测值，表明这一方案的临床应用价值较大，可以作为CC早期筛查方案。