SLC23A1基因rs10063949位点多态性与子痫前期关系及病人血清维生素C水平测定

柴青川 王西兵 张永杰 刘世国 刘颖 梁惠

[摘要] 目的 探讨编码钠离子依赖性维生素C转运蛋白1（SVCT1）的溶质载体家族23成员1（SLC23A1）基因rs10063949位点多态性与子痫前期遗传易感性的关系及子痫前期病人血清维生素C水平的变化。方法 选取山东地区1 029例子痫前期病人（病例组）和1 037例正常孕妇（对照组）作为研究对象，提取外周血DNA，采用TaqMan探针实时荧光PCR技术检测rs10063949位点基因型分布和等位基因频率;另外从病例组和对照组中随机抽取40例子痫前期病人和21例正常孕妇，测定其血清维生素C水平。结果 病例组和对照组相比，SLC23A1基因rs10063949位点的基因型分布和等位基因频率差异均无显著性（P>0.05），血清维生素C水平差异也无显著性（P>0.05）。结论 在山东汉族孕妇人群中SLC23A1基因rs10063949位点多态性可能与子痫前期遗传易感性没有关联;子痫前期病人血清维生素C水平未见明显变化。

[关键词] 先兆子痫;钠偶联维生素C转运子;多态性，单核苷酸;氧化性应激;抗坏血酸

[中图分类号] R714.244;R394.5  [文献标志码] A  [文章编号] 2096-5532（2020）06-0657-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.158 [开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200720.1444.007.html;

[ABSTRACT] Objective To investigate the association of rs10063949 polymorphism of the solute carrier family 23 member 1 （SLC23A1） gene encoding sodium-dependent vitamin C transporter 1 （SVCT1） with the genetic susceptibility of preeclampsia， as well as the change in the serum level of vitamin C in patients with preeclampsia.  Methods A total of 1 029 patients with preeclampsia and 1 037 normal pregnant women in Shandong， China were enrolled as case group and control group， respectively. Peripheral blood DNA was extracted， and TaqMan probe real-time fluorescence PCR was used to detect the genotype distribution and allele frequency at rs10063949. In addition， 40 patients with preeclampsia and 21 normal pregnant women were randomly selected from the case group and the control group to measure the serum level of vitamin C.  Results There were no significant diffe-rences in genotype distribution and allele frequency at the rs10063949 locus of the SLC23A1 gene between the case group and the control group （P>0.05）. There was also no significant difference in the serum level of vitamin C between the two groups （P>0.05）.  Conclusion The SLC23A1 rs10063949 polymorphism may not be associated with the genetic susceptibility of preeclampsia in the Chinese Han pregnant women in Shandong and there is no significant change in the serum level of vitamin C in patients with preeclampsia.

[KEY WORDS] pre-eclampsia; sodium-coupled vitamin C transporters; polymorphism， single nucleotide; oxidative stress; ascorbic acid

子癇前期（PE）为一种妊娠期高血压疾病，主要表现为妊娠20周后病人出现高血压和蛋白尿，并伴肝、肾、中枢神经系统和凝血系统等多脏器功能损害[1]。全球PE的发病率为3.2%～12.0%，我国发病率为4.2%，PE已成为孕产妇和围生期死亡的主要原因[2]。PE的病因和发病机制尚不清楚，目前认为与子宫螺旋小动脉重铸障碍、炎症免疫过度激活、血管内皮受损、胰岛素抵抗、遗传等因素有关[3-5]。有证据表明，氧化应激和胎盘抗氧化能力降低与PE的发生有关[6-9]。在妊娠早期，胎盘循环中氧消耗的增加伴随着活性氧（ROS）的生成增加[10]，ROS大量积聚可引起脂质过氧化、蛋白质羰基化和DNA氧化，导致血管内炎症反应和内皮细胞功能障碍[9]。谷胱甘肽过氧化物酶、维生素C、维生素E等抗氧化剂可以消除ROS对细胞过氧化的作用，抑制细胞损伤，维持细胞膜的完整性。当ROS的产生与抗氧化防御机制之间的平衡被打破时，就会产生氧化应激，从而进一步导致PE的发生[11-12]。

维生素C作为血浆中最有效的抗氧化剂之一，能够有效地清除氧自由基[13]。有研究结果显示，PE病人血清中维生素C的浓度低于正常孕妇，维生素C摄入量的增加能降低PE发生的风险[14]。钠依赖性维生素C转运蛋白1（SVCT1）由溶质载体家族23成员1（SLC23A1）基因编码，主要参与小肠对维生素C的吸收和肾脏对维生素C的重吸收[15]。CORPE等[16]研究发现，SLC23A1基因rs35817838、rs33972313、rs6886922及rs34521685单核苷酸多态性（SNP）位点不同的基因型会导致人体血浆维生素C的含量不同，提示SVCT1与人体内的维生素C水平相关。英国的一项队列研究发现，SLC23A1基因rs10063949位点与血液中维生素C水平增加有关[17]。目前该位点与PE是否相关尚不清楚。因此，本研究拟探讨PE病人体内维生素C水平及SLC23A1基因rs10063949位点多态性与山东地区PE风险的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2014年1月—2016年12月，于青岛大学附属医院、烟台毓璜顶医院、滨州医学院附属医院、临沂市人民医院、聊城市人民医院、枣庄市妇幼保健院，选取PE病人1 029例（病例组）和正常孕妇1 037例（对照组）。排除标准：有慢性高血压、肾脏疾病和（或）胰岛素依赖型糖尿病、双胎或多胎、葡萄胎、前置胎盘、胎儿积水、肝功能障碍、系统性红斑狼疮或系统性疾病等疾病;有吸烟、饮酒史者。对照组孕妇未行人工授精，未发生胎膜早破、前置胎盘、先兆流产、双胎、巨大儿、早产等疾病。对照组、病例组平均年龄分别为（30.06±5.82）、（30.26±3.93）岁，两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。本研究获青岛大学附属医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

PE的诊断标准：妊娠20周后出现收缩压≥18.62 kPa和（或）舒张压≥11.97 kPa，伴蛋白尿≥0.3 g/24 h或随机尿蛋白（+）[18]。重度PE临床表现：血压和尿蛋白持续升高，发生母体脏器功能不全或胎儿并发症。参照谢幸等主编的《妇产科学》（第8版），将34周之前发病者归为早发型PE，34周之后发病者归为晚发型PE。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血DNA提取 采集所有研究对象外周肘静脉血2 mL，EDTA抗凝，冻存于-80 ℃冰箱。用DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA。

1.2.2 SLC23A1基因rs10063949位点多态性检测应用TaqMan探针实时荧光PCR技术对SLC23A1 rs10063949位点进行多态性分析。rs10063949位点检测前引物为5′-GGCCTTGTGCCAAGAAAC-AT-3′，后引物为 5′-TCCATCTAATGCTCCTGCTATCTTT-3′。TaqMan等位基因鉴别的实时PCR体系25 μL，包括2×PCR Master Mix 12.5 μL、20×SNP探针1.25 μL、DNA无酶水10.25 μL和目的DNA 1 μL。在C1000TM热循环仪和CFX96TM实时系统（BIO-RAD，Hercules，CA）中进行扩增，条件如下：95 ℃、3 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共45个循环。在每个周期中，分别采集VIC或FAM标记探针的荧光信号。采用Bio-Rad CFX Manager 3.0软件进行基因型判别。

1.2.3 血清維生素C水平检测 采用随机抽样方法，从病例组和对照组中分别抽取40例PE病人和21例正常孕妇，测定其血清维生素C水平。采集外周肘静脉血4 mL至非抗凝管中，以3 500 r/min离心10 min，取血清。采用酶联免疫吸附试验方法检测血清维生素C含量，检测试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司，严格按照说明书进行操作。本次实验质控值均在规定范围内。

1.3 统计学分析

使用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量数据以±s表示，两组人口学特征和临床特征的比较采用t检验;两组等位基因频率和基因型分布的比较采用卡方检验，用比值比（OR）和95%置信区间（CI）来表示相对危险度。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结  果

2.1 两组人口学特征和临床特征的比较

病例组病人的年龄、妊娠和流产次数与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。与对照组相比，病例组孕周早（t=7.32，P<0.01）、子代出生体质量低（t=27.47，P<0.01）、收缩压和舒张压均升高（t=66.65、65.42，P<0.01），外周血谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的水平明显升高（t=7.43、8.02，P<0.01）。见表1。

2.2 遗传分析

2.2.1 两组基因型分布和等位基因频率比较 对照组孕妇rs10063949位点基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。两组孕妇SLC23A1基因rs10063949位点的基因型分布差异无显著意义（χ2=2.96，P>0.05），等位基因频率差异也无显著性（χ2=2.11，P>0.05）。将基因型进一步分为C等位基因显意义（CC/CT+TT）和T等位基因隐性（TT/CC+CT）亚组再进行比较，两组间差异仍未有显著性（χ2=0.68、2.89，P>0.05）。见表2。

2.2.2 早发型、晚发型PE与对照组基因型分布和等位基因频率的比较 早发型、晚发型PE病人与对照组比较，rs10063949位点的基因型分布差异无显著意义（χ2=3.17、1.05，P>0.05），等位基因频率差异也无显著意义（早发型PE与对照组：χ2=2.64，P>0.05，OR=1.15，95%CI=0.97～1.35;晚发型PE与对照组：χ2=0.57，P>0.05，OR=1.06，95%CI=0.91～1.24）。见表3。

2.2.3 轻度、重度PE与对照组基因型分布和等位基因频率的比较 轻度和重度PE病人与对照组比较，rs10063949位点的基因型分布差异无显著意义（χ2=2.00、3.18，P>0.05），等位基因频率差异也无显著意义（轻度PE与对照组比较：χ2=1.76，P>0.05，OR=1.17，95%CI=0.93～1.48;重度PE与对照组比较：χ2=1.36，P>0.05，OR=1.09，95%CI=0.95～1.25）。见表4。

2.3 两组血清维生素C水平比较

两组年龄差异无统计学意义（P>0.05）;PE病人孕周明显早于正常孕妇（t=4.26，P<0.05）;与正常孕妇比较，PE病人血清维生素C水平有降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表5。

3 讨  论

PE严重威胁孕妇及胎儿的健康，但目前PE的发病机制还尚未阐明。近年来，研究人员试图用胎盘缺血、氧化应激、内皮损伤、免疫学理论和遗传学理论等多种理论来解释PE的发病机制[19]。氧化应激是PE发病的重要原因，正常妊娠时，氧化/抗氧化水平处于动态平衡状态，但在PE病人中，由于中性粒细胞浸润和多种蛋白酶释放产生了大量的中间产物，使氧化产物增多，抗氧化物质减少，产生过多的氧化应激反应，导致细胞损伤[20]，使滋养细胞侵袭不足和子宫螺旋小动脉重塑障碍，从而导致胎盘灌注减少和PE的发生[21]。维生素C是一种抗氧化剂，可以与氧自由基反应而清除活性氧，参与多种生理病理的氧化应激反应，包括清除在此过程中产生的氧化物和氮化物，抑制动脉内皮细胞产生脂质过氧化物，从而保护细胞。维生素 C可以提高滋养细胞的抗氧化能力，参与胚胎形成、胎儿正常生长发育，对维持正常妊娠具有重要作用[22-23]。如果孕妇体内维生素C含量不足，抗氧化能力降低，氧化与抗氧化平衡失调，就会使子宫动脉的侵袭能力降低，滋养细胞从上皮细胞特征转变为内皮细胞特征减少，造成子宫螺旋小动脉重铸障碍，胎盘血流量降低，从而造成母体与胎儿的氧气和营养物质转运障碍，导致胎盘缺血和各种炎症因子的分泌，进一步引起PE的发生。维生素C摄入量的增加能降低PE发生的风险[14]。

人体自身不能合成维生素C，需要从食物中摄取。人体对维生素C的吸收主要依赖于钠离子维生素 C 转运蛋白（包括SVCT1和SVCT2），其中SVCT1由SLC23A1基因（位于染色体5q31.2-q31.3）编码[15，24]，在小肠吸收维生素C及肾重吸收维生素C中发挥重要的作用。TIMPSON等[17]研究发现， rs10063949位点SNP与血液中维生素C增加有关。敲除部分SVCT1基因的小鼠体内维生素C含量极低，维生素C在小肠内吸收明显减少，肝脏几乎不能储存维生素C，尿液中维生素C含量明显增多[16]。敲除SVCT1基因的SLC23A1（-/-）小鼠体内各组织中维生素C含量明显降低甚至不能检测到[25]。陈娟娟等[26]研究结果显示，PE病人外周血及脐血维生素C含量显著低于正常孕妇，胎膜和胎盘中SVCT1的阳性表达显著低于对照组。由此推测，SLC23A1基因rs10063949位点可能影响维生素C的吸收，导致PE发生。

本研究结果显示，PE病人和对照组SLC23A1基因rs10063949位点的基因型分布和等位基因频率差异均无显著性。将基因型分为C等位基因显性（CC/CT+TT）和T等位基因隐性（TT/CC+CT）亚组进行比较，两组间差异仍无显著性。本研究进一步将PE病人分为轻、重度和早、晚发型，分别与对照组进行比较，结果显示rs10063949位点基因型分布和等位基因频率差异均无显著性。總之，本研究未显示SLC23A1基因rs10063949位点多态性在山东地区汉族人群PE发生发展中的作用，提示该位点对山东地区汉族人群PE的发病可能没有影响。由此推测，SLC23A1基因rs10063949位点可能不会影响山东地区汉族人群维生素C的吸收。

虽然有研究显示PE病人体内血清维生素C水平明显低于正常孕妇[27-28]，但本研究中PE病人维生素C水平与对照组相比没有显著降低。BASARAN等[29]通过分析15项补充抗氧化剂试验，认为补充维生素C并不能预防PE。ROBERTS等[30]对妊娠9～16周孕妇的研究结果表明，联合补充维生素C（1 000 mg/d）和维生素E（400 U/d）不能降低PE发病率。推测原因可能与胎盘细胞、内皮细胞吸收维生素C，维生素C在细胞内代谢、发挥抗氧化作用有关，这还需要做进一步的研究。

PE是一种复杂的多致病因素的疾病，遗传背景、生活方式、饮食、季节气候、体质量指数、吸烟、饮酒、营养等多种因素可能会影响PE的发生发展。本研究存在以下不足：样本选自山东省内，并且只研究了SLC23A1基因rs10063949位点这一个基因位点，PE发病可能还与其他多个基因位点有关;没有对样本周围环境、生活方式以及胎儿等方面进行研究分析;血清中维生素C水平反映近期维生素C的摄入情况，未能检测PE病人组织中维生素C的储存水平;没有对SLC23A1基因rs10063949位点与山东地区汉族人群血清维生素C水平及体内维生素C储存水平是否相关进行分析。因此，有必要在不同的种族和地区进行涉及SLC23A1基因的大规模研究，并进行功能和环境分析，进一步探讨PE的发病机制。

[参考文献]

[1] MOL B， ROBERTS C T， THANGARATINAM S， et al. Pre-eclampsia[J]. Lancet， 2016，387（10022）：999-1011.

[2] 庄彩霞，刘俊涛，高劲松. 中国人群子痫前期发病率和临床危险因素分析[J]. 生殖医学杂志， 2019，28（4）：336-341.

[3] RANA S， KARUMANCHI S A， LINDHEIMER M D. Angiogenic factors in diagnosis， management， and research in preeclampsia[J]. Hypertens Dallas Tex：1979， 2014，63（2）：198-202.

[4] JEBBINK J， WOLTERS A， FERNANDO F， et al. Molecular genetics of preeclampsia and HELLP syndrome-a review[J]. Biochim et Biophys Acta， 2012，1822（12）：1960-1969.

[5] JIA R Z， DING G C， GU C M， et al. CDX2 enhances HTR-8/SVneo trophoblast cell invasion by altering the expression of matrix metalloproteinases[J]. Cellular Physiology and Biochemistry， 2014，34（3）：628-636.

[6] HANSSON S R， NV， ERLANDSSON L. Oxidative stress in preeclampsia and the role of free fetal hemoglobin[J]. Front Physiol， 2014，5：516.

[7] FUJITA D， TANABE A， SEKIJIMA T， et al. Role of extracellular signal-regulated kinase and AKT cascades in regulating hypoxia-induced angiogenic factors produced by a trophoblast-derived cell line[J]. J Endocrinol， 2010，206（1）：131-140.

[8] WIKSTRM A K， NASH P， ERIKSSON U J， et al. Evidence of increased oxidative stress and a change in the plasminogen activator inhibitor （PAI）-1 to PAI-2 ratio in early-onset but not late-onset preeclampsia[J]. Am J Obstet Gynecol， 2009， 201（6）：597.e1-597.e8.

[9] WU F， TIAN F J， LIN Y. Oxidative stress in placenta： health and diseases[J]. Biomed Res Int， 2015， 2015：293271.

[10] GAO H J， LIU C， LIN P， et al. Effects of GSTP1 and GPX1 polymorphisms on the risk of preeclampsia in Chinese Han women[J]. Cell Physiol Biochem： Int J Exp Cell Physiol Biochem Pharmacol， 2016，39（5）：2025-2032.

[11] CHAIWORAPONGSA T， CHAEMSAITHONG P， YEO L， et al. Pre-eclampsia part 1： current understanding of its pathophysiology[J]. Nature Reviews Nephrology， 2014，10（8）：466-480.

[12] SNCHEZ-ARANGUREN L C， PRADA C E， RIAO-MEDINA C E， et al. Endothelial dysfunction and preeclampsia： role of oxidative stress[J]. Frontiers in Physiology， 2014，5：372.

[13] MERCER B M， ABDELRAHIM A， MOORE R M， et al. The impact of vitamin C supplementation in pregnancy and in vitro upon fetal membrane strength and remodeling[J]. Reproductive Sci Thousand Oaks Calif， 2010，17（7）：685-695.

[14] KAZEMIAN E， DOROSTY-MOTLAGH A R， SOTOUDEH G， et al. Nutritional status of women with gestational hypertension compared with normal pregnant women[J]. Hypertens Pregnancy， 2013，32（2）：146-156.

[15] BRZLE M， SUZUKI Y， ACKERMANN D， et al. Thesodium-dependent ascorbic acid transporter family SLC23[J]. Mol Aspects Med， 2013，34（2-3）：436-454.

[16] CORPE C P， TU H B， ECK P， et al. Vitamin C transporter Slc23a1 links renal reabsorption， vitamin C tissue accumulation，and perinatal survival in mice[J]. J Clin Investig， 2010，120（4）：1069-1083.

[17] TIMPSON N J， FOROUHI N G， BRION M J， et al. Genetic variation at the SLC23A1 locus is associated with circulating concentrations of L-ascorbic acid （vitamin C）： evidence from 5 independent studies with >15，000 participants[J]. Am J Clin Nutr， 2010，92（2）：375-382.

[18] 中华医学会妇产科学分会妊娠期高血压疾病学组. 妊娠期高血压疾病诊治指南（2015）[J]. 中华围产医学杂志， 2016，19（3）：161-169.

[19] DE SOUSA ROCHA V， DELLA ROSA F B， RUANO R， et al. Association between magnesium status， oxidative stress and inflammation in preeclampsia： a case-control study[J]. Clinical Nutrition， 2015，34（6）：1166-1171.

[20] GUPTA S， AZIZ N， SEKHON L， et al. Lipid peroxidation and antioxidant status in preeclampsia： a systematic review[J]. Obstet Gynecol Surv， 2009，64（11）：750-759.

[21] JAUNIAUX E， WATSON A L， HEMPSTOCK J， et al. Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress. A possible factor in human early pregnancy failure[J]. Am J Pathol， 2000，157（6）：2111-2122.

[22] JAUNIAUX E， CINDROVA-DAVIES T， JOHNS J， et al. Distribution and transfer pathways of antioxidant molecules inside the first trimester human gestational sac[J]. J Clin Endocrinol Metab， 2004，89（3）：1452-1458.

[23] 钟少平，刘霞，周晓宇，等. 维生素C对缺氧诱导人滋养细胞凋亡的影响研究[J]. 中国妇幼保健， 2012，27（25）：3980-3982.

[24] BRZLE M， HEDIGER M A. Functional and physiological role of vitamin C transporters[J]. Curr Top Membr， 2012，70：357-375.

[25] SOTIRIOU S， GISPERT S， CHENG J， et al. Ascorbic-acid transporter Slc23a1 is essential for vitamin C transport into the brain and for perinatal survival[J]. Nature Medicine， 2002，8（5）：514-517.

[26] 陈娟娟，程澄，谢玉珍，等. 维生素C及其转运体SVCT在子痫前期发病机制中的作用研究[J]. 实用妇产科杂志， 2016，32（4）：282-285.

[27] 甘艳琼，陈朝霞，张娟，等. 妊娠期维生素C、E及微量元素铜、锌与子痫前期相关性研究[J]. 中国妇产科临床杂志， 2019，20（5）：456-457.

[28] LLURBA E， GRATACS E， MARTN-GALLN P， et al. A comprehensive study of oxidative stress and antioxidant status in preeclampsia and normal pregnancy[J]. Free Radic Biol Med， 2004，37（4）：557-570.

[29] BASARAN A， BASARAN M， TOPATAN B. Combined vitamin C and E supplementation for the prevention of preeclampsia： a systematic review and meta-analysis[J]. Obstetrical & Gynecological Survey， 2010，65（10）：653-667.

[30] ROBERTS J M， MYATT L， SPONG C Y， et al. Vitamins C and E to prevent complications of pregnancy-associated hypertension[J]. N Engl J Med， 2010，362（14）：1282-1291.

（本文編辑 马伟平）