国内外不同产区和类型雪茄烟烟草特有亚硝胺及生物碱含量分析

孙雨琦，赵园园，周迪，钟秋，王俊，周骏，曾代龙，秦艳青，刘德水，杨兴有，李晶晶，陈勇，史宏志

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室/烟草农业减害研究中心，郑州市金水区文化路95号 450002；

2 四川省烟草公司德阳市公司，四川省德阳市什邡回镇青雀路30号 618400；

3 上海烟草集团北京卷烟厂有限公司，北京市通州区万盛南街99号 100024；

4 四川中烟工业有限责任公司长城雪茄烟厂，四川省德阳市什邡经济开发区华山路南段128号 618400；

5 中国烟草总公司四川省公司，成都市高新区世纪城路936号 600041

烟草特有亚硝胺（tobacco-specifcnitrosamine，TSNA）是烟草生物碱和亚硝酸盐发生亚硝化反应生成的化合物，在烟叶和烟气中都有存在，现已证实的有8 种[4]，其中最主要的4 种为N-亚硝基降烟碱（NNN），4-（甲基亚硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK），N-亚硝基假木贼碱（NAB）和N-亚硝基新烟碱（NAT）[5]。有研究表明，NNN 和NNK 具有一定的致癌性和致突变性[6-7]。NNK 又被确定为影响卷烟烟气危害性最重要的7 有害成分指标之一[8]。因此认为，TSNA 的含量和组成直接影响烟草制品的安全性。史宏志等发现不同产地的烟叶样品中，白肋烟烟叶的TSNAs 含量最高，香料烟次之，烤烟则远低于白肋烟和部分香料烟[9]。而目前关于不同产区雪茄烟叶TSNAs 含量和雪茄烟安全性的研究较少，摸清国内外雪茄烟叶中烟草特有亚硝胺的现状，对于客观评价和进一步提高雪茄烟叶产品的安全性具有重要意义。

生物碱是形成TSNAs 的主要前体物之一[10]。烟草中生物碱的组成主要有四种，分别为烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱[11]。一般情况下，烟碱占总生物碱含量的94%以上，降烟碱含量低于总生物碱含量的3.5%[12]。然而，烟叶群体中，一些烟株由于发生基因突变而产生烟碱去甲基能力，导致烟碱转化为降烟碱，造成生物碱组成发生显著变化，这不仅影响烟叶的香味品质和满足感，还会因为降烟碱极易与亚硝酸发生亚硝化反应导致亚硝基降烟碱（NNN）和总TSNAs 含量升高[13-15]。关于烟碱转化方面的研究主要集中在白肋烟上[16-18]，而对于雪茄烟叶生物碱组成的分析及其与烟草特有亚硝胺关系则鲜有报道。国内雪茄烟市场广阔，但目前仍然处于起步阶段[19]。要进一步促进行业雪茄烟高质量发展，应充分考虑雪茄烟叶优质和安全问题。本试验系统研究了国内外不同产区雪茄烟叶TSNAs、生物碱的含量并对其相关性进行了分析，这对于明析国内外雪茄原料生物碱和TSNAs 的整体水平以及含量差异具有重要意义，以便于后期采取更有针对性的措施降低雪茄烟叶和制品的健康风险。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验收集了55 个雪茄烟叶样品，均为各个产区主栽品种于2019 年发酵后的中部叶。试验过程中对样品进行分类，其中按产区分为中美洲（多米尼加10 个、古巴8 个）、南美洲（巴西7 个）、东南亚（印尼13 个）、中国（四川德阳6 个、四川达州5 个、海南4 个、湖北来凤2 个），计为4 个产区；按雪茄类型分为茄芯（29 个）、茄衣（13 个）、茄套（13 个），计为3 种类型。

1.2 化学分析方法

1.2.1 生物碱测定

采用气相色谱法，将雪茄烟样品于50℃烘干后粉碎，过250 μm 筛。每样品称取200 mg，烟末置于15 mL 旋盖培养试管中，加入内标溶液（7.5 μg/μL 正十六烷内标溶液）100 μL，10%NaOH 溶液1.5 mL，甲基叔丁基醚3 mL，旋紧旋盖，充分振荡5 min 后，室温放置（24±2）h 后提取上层清液通过Agilent 7890A 型气相色谱-氢火焰离子化检测器（美国Agilent Technologies公司）定量分析4种生物碱（烟碱、降烟碱、假木贼碱、新烟草碱）的含量并以其含量之和作为总生物碱含量。烟碱转化率（%）=［降烟碱含量/（烟碱含量+降烟碱含量）］×100。

1.2.2 TSNAs 测定

雪茄烟样品中的TSNAs 由上海烟草集团有限责任公司北京卷烟厂进行测定，采用SPE-液相色谱质谱联用（SPE-LC-MS/MS）法［SPE-LC：Symbiosis（Pico），Spark Holland（上海仪真分析仪器有限公司）；MS/MS：triplequad5500，ABSciex（上海爱博才思分析仪器贸易有限公司）］。称取1.0 g 烟样，置50 mL 锥形瓶中，加入40 μL 的4 种氘代TSNAs（内标）溶液（5000 ng/mL）和30 mL 的100 mmol/L乙酸铵水溶液，在室温下振荡（200 r/min，萃取60 min），萃取液过0.45 μm 水相滤膜后使用LC-MS/MS 检测TSNAs 含量（质量分数），NNN、NNK、NAT 和NAB 含量之和为TSNAs 总量。

1.3 数据处理

运用Excel 2010 对原始数据进行标准化处理，运用DPS 7.05 进行相关分析，用LSD 法比较均值差异的显著性，采用Excel 2007 绘图制表。

2 结果分析

2.1 雪茄烟生物碱含量及变异

2.1.1 不同产区雪茄烟生物碱含量状况及变异分析

从4 个产区的生物碱含量来看（图1），国内外产区的样品均以烟碱含量最高，为0.66%～10.02%，平均值2.69%；假木贼碱含量最低，均在0.07%以下；降烟碱、新烟草碱含量均在0.80%以下；烟碱转化率为2.07%～28.01%，平均值7.66%，变化范围较广。

由表1 可知，国内外产区之间的样品降烟碱含量无显著差异，国内产区样品的烟碱和总生物碱含量显著高于南美洲和东南亚；假木贼碱和新烟草碱含量显著高于国外3 个产区；烟碱转化率显著低于南美洲，但与中美洲、东南亚无显著差异。除中美洲和东南亚产区的假木贼碱以外，各个产区的主要生物碱及总生物碱含量的变异系数均在40%以上，变异性较大。国内外产区雪茄样品的烟碱转化率变异系数均在70%以上，且各个产区内均有烟碱转化率高于15%的雪茄样品，因此认为雪茄烟叶普遍存在烟碱向降烟碱转化的问题。

2.1.2 不同类型雪茄烟生物碱含量状况及变异分析

按雪茄烟类型对生物碱含量进行分析（图2），茄芯、茄衣、茄套样品的烟碱含量分别在1.92%～10.02%、0.66%～2.36%、1.03%～2.43%之间，总生物碱含量分别在2.02%～10.90%、0.73%～3.20%、1.30%～2.70%之间，降烟碱、假木贼碱、新烟草碱含量均低于1.00%。各类型雪茄样品的烟碱转化率在2.07%～28.01%之间，平均值为7.66%。

结合表2 可知，不同类型雪茄样品的降烟碱含量无显著差异，而茄芯样品的烟碱、假木贼碱、新烟草碱、总生物碱含量均显著高于茄衣、茄套。茄衣样品的烟碱转化率显著高于茄芯、茄套，而茄芯与茄套间的烟碱转化率无差异显著。三种不同类型雪茄样品的降烟碱及烟碱转化率变异系数均在60%以上，烟碱转化率变异幅度较大。

图1 不同产区雪茄烟生物碱含量Fig. 1 Contents of alkaloids in cigars from different production areas

表1 不同产区雪茄样品生物碱含量变异情况Tab. 1 Variation of alkaloids contents in cigar samples from different production areas

图2 不同类型雪茄烟生物碱含量Fig. 2 Contents of alkaloids in different types of cigar samples

表2 不同类型雪茄样品生物碱含量变异情况Tab. 2 Variation of alkaloid content in different types of cigar samples

2.2 雪茄烟TSNAs 含量及变异

2.2.1 不同产区雪茄烟TSNAs 含量状况及变异分析从4 个产区的TSNAs 含量来看（图3），国内外各个产区样品NNN 的含量为0.63 μg/g ～20.91 μg/g，平均值为4.06 μg/g；NAT 的含量为范围在0.21 μg/g ～8.64 μg/g，平均值为1.94 μg/g；NAB 和NNK 的含量均在1.30 μg/g以下；总TSNAs 的含量为1.46 μg/g ～25.75 μg/g，平均值为6.47 μg/g。从TSNAs 组成来看，NNN 和NAT所占TSNAs 的比例相对较高，是TSNAs 中的主要成分。

图3 不同产区雪茄烟TSNAs 含量Fig. 3 TSNAs content of cigars from different producing areas

表3 不同产区雪茄样品TSNAs 含量变异情况Tab. 3 Variation of TSNAs contents in cigar samples from different production areas μg/g

由表3 可知，国内产区样品的NNN、NAT、NAB 及总TSNAs 含量显著低于南美洲，但与中美洲、东南亚无显著差异。国内产区样品的NNK 含量显著低于东南亚，但与中美洲、南美洲无显著差异。此外，国内外各个产区样品的NNN、NAT、NAB、NNK 及总TSNAs 含量变异系数均在45%以上，变异幅度较大。

2.2.2 不同类型雪茄烟TSNAs 含量状况及变异分析

按雪茄类型对TSNAs 含量进行分析（图4），茄芯、茄衣、茄套样品的NNN 含量分别在0.63 μg/g～6.52 μg/g、0.66 μg/g～11.95 μg/g、1.02 μg/g～20.91 μg/g 之 间，NAT 含 量 分 别 在0.21 μg/g～5.89 μg/g、0.35 μg/g～8.64 μg/g、0.74 μg/g～4.23 μg/g 之间。从总TSNAs 含量来看，茄芯样品为1.77 μg/g～10.97 μg/g，平均值4.98 μg/g；茄衣样品为1.46 μg/g～21.13 μg/g，平均值7.69 μg/g；茄套样品为2.08 μg/g～25.75 μg/g，平均值8.55 μg/g。

由表4 可知，茄套样品的NNN 含量显著高于茄芯样品，NNK 含量显著高于茄芯、茄衣样品；而三种不同类型样品的NAT、NAB 及总TSNAs 含量均无显著差异。三种类型雪茄样品NNN、NAT、NAB、NNK 及总TSNA 含量变异系数均在45%以上，变异幅度较大。

图4 不同类型雪茄烟TSNAs 含量Fig. 4 TSNAs content in different types of cigar samples

表4 不同类型雪茄样品TSNAs 含量变异情况Tab. 4 Variation of TSNAs content in different types of cigar samples μg/g

2.3 雪茄烟TSNAs 与生物碱的关系

以烟碱转化率5%为分界线，将55 个样品原料大致分为24 个转化株和31 个非转化株两部分，分别对其TSNAs 与生物碱含量进行相关性分析（表5），当烟碱转化率大于5%或小于5%时，雪茄烟降烟碱与NNN、总TSNAs 均呈显著正相关关系。当烟碱转化率小于5%时，烟碱转化率与NNN、总TSNAs 含量无显著相关关系；当烟碱转化率大于5%时，烟碱转化率与NNN、总TSNAs 含量呈极显著正相关关系，说明烟叶样本不同可直接影响TSNAs 前体物对TSNAs 形成的贡献，烟碱转化率较高的烟叶，烟碱转化对TSNAs 形成的贡献度提高。

3 讨论

生物碱是雪茄烟叶核心化学成分，其组成和含量不仅直接影响雪茄烟叶香味品质和生理强度，而且作为烟草中重要的有害物质烟草特有亚硝胺合成的前体物，对雪茄烟叶调制和发酵过程中烟草特有亚硝胺的形成和积累起重要作用，因此，适宜的生物碱含量水平和合理的生物碱组成是优质低害雪茄烟叶生产的必然要求。本试验表明，国内外不同产区雪茄烟叶和茄芯、茄衣等不同用途雪茄烟叶生物碱含量样本间差异性均较大，特别是烟碱、降烟碱含量和烟碱转化率变异性极大，表明雪茄烟叶烟碱向降烟碱转化问题突出。烟碱转化导致烟碱含量异常降低，可显著影响雪茄烟叶香气呈现和风格特征，降低生理满足感和醇厚度，同时，由于烟碱去甲基后形成的仲胺类降烟碱极易发生亚硝化反应形成NNN，可造成总TSNAs 水平大幅增加。本研究表明，不同产地和不同用途雪茄烟叶NNN 和总TSNAs 含量的样本间变异性也均较大，相关分析表明，降烟碱含量与NNN 和总TSNAs 含量呈显著正相关关系，说明烟碱转化导致的降烟碱含量增加是目前雪茄烟叶NNN 和总TSNA 含量水平增高的主要原因。

表5 不同分类雪茄烟TSNAs 与生物碱的相关系数Tab. 5 Correlation coefficient between TSNAs and alkaloid of different cigar samples

烟草特有亚硝胺的合成前体物是生物碱和亚硝酸，这两类前体物的形成受遗传、栽培和生态因素的综合影响[13]。从本试验结果看，虽然不同产地雪茄烟叶的生态条件和栽培技术有较大差异，但生物碱和烟草特有亚硝胺含量的地区间差异相对较小，这可能是因为目前不同产区和不同用途雪茄烟叶存在的主要问题是烟碱转化性状的稳定性较差，变异性较大，因而掩盖了生态条件和栽培管理等方面可能造成的差异，因此，从目前来看，针对烟碱转化性状对雪茄品种进行遗传改良，对生物碱组成进行优化，去除转化株，降低群体烟碱转化率是保证和稳定生物碱含量水平，降低烟草特有亚硝胺含量的有效途径和紧迫任务。在此基础上，可进一步探究生态环境和栽培、调制技术与烟草特有亚硝胺形成的关系，确定雪茄烟叶进一步增质减害的技术途径。此外，本试验对品种分析有一定局限性，因此，可能品种的实质性影响会被掩盖。下一步我们将在鉴别转化株的基础上，选用同一品种的非转化株进行设计，比如用同一品种的非转化株系或同一转化水平的株系在不同生态区进行种植，这样可以消除烟碱转化的影响和干扰，更科学地比较和分析生态因素对生物碱和TSNAs 的影响，也可进一步分析不同用途烟叶的真实差异。本试验也表明，采用烟碱转化率不同的样本进行分析，发现烟碱转化率与TSNA 形成的相关性不尽相同，表明降烟碱对TSNA 形成的贡献不同，与Cai 等[20]的研究一致。因此，在解决雪茄烟叶烟碱转化问题后，仍有新的课题值得研究。雪茄烟叶一般采用晾制方式进行调制，而且要需要经过独特的发酵过程，关于烟叶调制过程中TSNA 的形成机理目前研究的较为清楚[18,21,22]，但在雪茄烟调制过程中TSNA 的形成规律，特别是发酵过程中TSNA 形成机理尚需深入研究。

4 结论

不同产地和不同用途雪茄烟叶生物碱组成和含量、烟碱转化率样本间差异性均较大，烟碱向降烟碱转化是目前雪茄烟叶存在的突出问题。不同产地和用途雪茄烟叶TSNAs 含量总体较高，样本间差异和变异性较大，雪茄烟叶降烟碱与NNN 和TSNAs 存在显著的正相关关系。对现有雪茄烟叶品种进行改良，优化生物碱组成，稳定生物碱水平是当务之急，对优质低害中式雪茄烟叶生产至关重要。