响应面优化黑曲霉生物发酵花生粕脱除黄曲霉毒素研究

邱天宇，王海鸣，朱 瑜，杨 阳，纪 剑，孙秀兰

（1.江南大学食品学院，江苏无锡 214122；2.广州广电计量检测股份有限公司，广东广州 510665；3.汉中市质量技术检验检测中心，陕西汉中 723000；4.新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

0 引言

黄曲霉毒素是曲霉属真菌的次生代谢产物，对人类和动物危害显著[1-2]，对食品的污染是食品安全领域最棘手的问题之一[3-4]。黄曲霉毒素主要分为4 种，分别为黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，这4 种毒素化学结构相似（如图1），致毒基团大致相同[5]，其中以AFB1毒性和致癌性最强[6-7]。并且，AFB1具有较高的分解温度，在常规食品加工温度范围内（80～121 ℃） 时被认为是热稳定的[8]。多种谷物都易感染曲霉，尤其花生[9-10]。花生粕作为花生榨油的副产品，产量高且蛋白质含量丰富，可利用其成为一种蛋白质功能性食品[11-13]，但由于其极易受霉菌污染，从而限制了应用[14-15]。黄曲霉毒素残留于花生粕中导致其污染率较高，应尽可能降低其中黄曲霉毒素含量。然而，目前较多农产品中存在着多种黄曲霉毒素，因此试验通过优化生物发酵工艺条件尽可能降低花生粕中4 种黄曲霉素含量。

AFB1(a)，AFB2(b)，AFG1(c)，AFG2(d)化学结构图见图1。

生物发酵是一种易于实施和较为经济的生物技术，不仅在农产品应用中占据着重要地位[16-17]，而且在脱除粕类有毒物质方面也有着广泛的应用[18-20]。降解菌株FS10 已证明其生物安全性[21]，不仅表现出优异的AFB1降解能力，而且有望作为工业发酵菌株在食品工业中发挥作用。

利用黑曲霉生物发酵花生粕的方法有效脱除花生粕中AFB1，AFB2，AFG1，AFG24 种黄曲霉毒素，研究接种量、发酵温度、发酵时间、料液比4 个因素对花生粕中黄曲霉毒素的脱除，采用响应面法对其中AFB1和总AFT（AFB1+AFB2+AFG1+AFG2） 脱除率进行优化，通过对发酵条件的优化发现该黑曲霉对4 种黄曲霉毒素的脱除有着显著效果。

1 材料与方法

1.1 试剂与培养基

AFB1，AFB2，AFG1，AFG2标准品，纯度为99.9%，美国Sigma 公司提供；甲醇、乙腈（色谱纯），美国TEDIA 公司提供；硫酸镁等化学纯试剂，上海国药集团化学试剂有限公司提供。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA 培养基）：马铃薯300 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，氯霉素0.1 g，蒸馏水1 L，于121 ℃下高压灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS，美国沃特世公司产品；VB-40 型立式高温高压灭菌锅，德国SYSTEC 产品；BSC-1300 型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；SHP-150 型生化培养箱，上海森信实验仪器有限公司产品；电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；THZ-D 型台式恒温振荡器，上海百典仪器设备有限公司产品；EX-OHOUS 型电子天平、旋涡振荡仪，美国奥豪斯公司产品；Scientz-10N 型台式冷冻干燥机、Scientz-10LS 型真空离心浓缩仪、SB-5200DT 型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；Eppendorf 型离心机，德国艾本德公司产品；Milli-Q型超纯水仪，美国Millipore 公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 黑曲霉及FS10 孢子悬浮液的制备

从酱醅中筛选出一株具有降解黄曲霉毒素能力的FS10 黑曲霉菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO:M2013703。从-80 ℃取出黑曲霉FS10 复苏，接种于种子培养基，于28 ℃下培养7 d，然后用无菌生理盐水（含0.05%吐温-80） 将孢子洗下，调整孢子含量为1×106CFU/mL，备用。

1.3.2 生物发酵

将花生粕粉碎，过40 目筛后混合均匀收集样品花生粕，备用。利用GB/T 14699.1—2005 方法采样并称取花生粕分装于50 mL 三角锥形瓶中，4 层纱布报纸封口，进行121 ℃，20 min 灭菌处理。

将灭菌处理过的花生粕转移至发酵容器中，加入无菌水至一定料液比（花生粕质量与无菌水体积的比值，g/mL），加入FS10 孢子悬浮液至一定接种量（菌液体积与花生粕质量的百分比），搅拌均匀后于一定温度下恒温发酵，分别在发酵后一定时间取样。

1.3.3 AFB1，AFB2，AFG1，AFG24 种黄曲霉毒素的测定

收集发酵完成的样品，干燥后分别将每份花生粕导入离心管内，加入乙腈-水溶液（70+30） 进行提取并冲洗发酵容器一并导入离心管内，避免因粕中毒素分布不均对试验结果的影响，混匀后超声处理10 min，振荡30 min，以转速8 000 r/min 离心10 min，取过滤后上清液过固相净化柱，收集液体后进行冷冻浓缩，用甲醇-水溶液（50+50） 复溶过滤膜后，上LC-MS/MS 检测。

取无菌花生粕样品，该组为无菌对照组，按上述方法提取毒素、检测。

配制黄曲霉毒素AFB1，AFB2，AFG1，AFG2混标：质量浓度梯度为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 ng/mL 的系列标准溶液。

1.3.4 色谱条件

色谱条件：色谱柱为BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相A 为乙腈，B 为甲酸铵溶液，柱温45 ℃，流速0.3 mL/min，进样量5 μL。

梯度洗脱见表1。

表1 梯度洗脱

质谱条件：离子方式ESI+，毛细管电压3.50 kV，锥孔电压30 V，离子源温度110 ℃，脱溶剂气温度400 ℃，流速700 lit/hr；锥形气流50 lit/hr，碰撞能量6 eV，质量范围20～800 m/z，探测器电压1 800 eV，碰撞气体流量0.15 mL/min；多反应监测模式（MRM）。

1.3.5 单因素试验

以AFB1，AFB2，AFG1，AFG2脱 除 率 为 指 标，控制孢子悬浮液含量为1×106CFU/mL，分别对接种量1%，5%，10%，15%，20%；发酵温度20，25，30，35，40 ℃；发酵时间24，36，48，60，72 h；料液比1∶0，1∶0.5，1∶1.0，1∶1.5，1∶2.0 进行单因素试验，确定各因素对黄曲霉毒素脱除情况的影响。

1.3.6 响应面法因素水平设计

根据单因素试验结果，利用Box-behnken 设计方法，选择接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、料液比（D） 作为4 个因素，以AFB1和总AFT脱除率作为响应值进行响应面优化设计。

1.4 数据处理

所有试验均重复3 次，采用SPSS19.0、Origin 2018、Design Expert 10 软件对数据进行处理分析及图像绘制。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 接种量对4 种黄曲霉毒素毒素脱除率的影响

在孢子悬浮液含量为1×106CFU/mL，料液比1∶1，培养温度30 ℃，发酵时间48 h 条件下，研究接种量分别为1%，5%，10%，15%，20%对4 种黄曲霉毒素脱除效果。

接种量对黑曲霉脱除4 种黄曲霉毒素的影响见图2。

不同接种量对于黑曲霉脱除花生粕中的黄曲霉毒素有着重要影响，接种量过小或过大均不利于发酵的进行。图2 表明了不同接种量对脱除4 种黄曲霉毒素的影响结果，在接种量为15%，20%时，AFB1，AFB2，AFG2脱除率都比较高，在接种量为5%～15%时AFG1脱除率较为稳定，但接种量为20%时，AFG1、AFG2脱除率有明显下降现象，推测AFG1，AFG2是中间降解产物的可能，仍需进一步研究。

2.1.2 发酵温度对4 种黄曲霉毒素毒素脱除率影响

在孢子悬浮液含量为1×106CFU/mL，料液比1∶1，接种量10%，发酵时间48 h 条件下，研究发酵温度分别为20，25，30，35，40 ℃对4 种黄曲霉毒素脱除率影响。

发酵温度对黑曲霉脱除4 种黄曲霉毒素的影响见图3。

不同温度会对微生物生命活动产生极大的影响，且对同一微生物而言，微生物最适生长温度与发酵速度最高的温度不一定相同，故试验研究了不同温度对黑曲霉脱除花生粕中黄曲霉毒素的影响。由图3可以看出在温度分别达到30，25 ℃时AFB1，AFG1脱除率已达最高，分别为82.69%，53.43%，而AFB2和AFG2脱除率在40 ℃时有突增现象，可能由于在低温脱除过程中AFB1和AFG1的末端呋喃环双键结构已断裂，导致所转化的中间产物AFB2和AFG2在此时脱除率不明显，而升高温度促进毒素其他结构的破坏，从而出现升温脱除率突增。有研究指出，在酸性溶液中AFB1和AFG1分别转化成AFB2和AFG2[22]，所以在后续试验中对总AFT 脱除率的监测是有必要的。

2.1.3 发酵时间对4 种黄曲霉毒素毒素脱除率的影响

在孢子悬浮液含量为1×106CFU/mL，料液比1∶1，接种量10%，培养温度30 ℃条件下，研究发酵时间分别为24，36，48，60，72 h 对4 种黄曲霉毒素脱除率的影响。

发酵时间对黑曲霉脱除4 种黄曲霉毒素的影响见图4。

发酵时间是发酵过程中的重要参数之一，由图4可以看出AFB1，AFB2，AFG1，AFG24 种毒素脱除率随时间的延长而升高，AFG1脱除率到36 h 后基本保持稳定，AFB1，AFB2，AFG23 种毒素脱除率到60 h后基本保持稳定，可能由于发酵后期菌体受到营养物质及发酵环境的限制，影响了其代谢生长。

2.1.4 料液比对4 种黄曲霉毒素毒素脱除率的影响

在孢子悬浮液含量为1×106CFU/mL，接种量10%，培养温度30 ℃，发酵时间48 h 条件下，研究料液比分别为1∶0，1∶0.5，1∶1.0，1∶1.5，1∶2.0对4 种黄曲霉毒素脱除率影响。

料液比对黑曲霉脱除4 种黄曲霉毒素的影响见图5。

料液比在微生物发酵过程中发挥至关重要的作用，从图5 可以看出在料液比为1∶0 时，严重限制了菌体正常代谢活动，从而影响4 种毒素脱除效果。料液比为1∶1.5 时，AFB1，AFB2，AFG1，AFG24 种毒素脱除率分别为93.05%，53.23%，62.11%，65.06%，综合4 种毒素脱除率，较为适宜的料液比为1∶1.5。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计因素与水平

为了得到黑曲霉脱除花生粕中黄曲霉毒素的最佳条件，根据上述单因素试验得到的较优条件，采用响应面法对接种量、料液比、发酵时间、发酵温度4 个因素两两交互影响进行试验设计。

响应面试验因素与水平设计见表2。

表2 响应面试验因素与水平设计

通过单因素试验确定黑曲霉生物发酵脱除黄曲霉毒素的4 个单因素适宜范围，由于AFB1毒性最大，现今国内外对黄曲霉毒素总量关注度极高，所以试验选取AFB1和总AFT 脱除率为考查指标进行响应面优化。

响应面试验设计及结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果

2.2.2 响应面回归模型的建立与分析

通过Design Expert 10 对试验结果进行回归拟合及方差分析，得到以AFB1脱除率（Y1） 和总AFT 脱除率（Y2） 为响应值，接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、料液比（D） 的多元二次回归方程：

为检验回归方程有效性，对回归方程进行方差和显著性分析。

AFB1脱除率回归模型方差分析见表4，总AFT脱除率回归模型方差分析见表5。

表4 AFB1 脱除率回归模型方差分析

结果表明，2 个回归模型均极显著（p＜0.001），2 个失拟项均不显著（p＞0.05），R2分别为0.977 8，0.978 6，R2adj分别为0.958 6，0.957 2，表明该模型能够较好地拟合数据，该回归方程可用于预测分析且能较好地反映各因素与响应值之间的关系。由表3、表4 可知，AFB1脱除率的影响因素主次顺序为发酵时间＞接种量＞发酵温度＞料液比，总AFT 脱除率的影响因素主次顺序为发酵时间＞接种量＞料液比＞发酵温度。

2.2.3 各因素两两交互作用

各因素交互作用对AFB1脱除率影响的响应面图见图6，各因素交互作用对总AFT 脱除率影响的响应面图见图7。

图6（a）、6（b）、6（c） 反映了接种量与其他3 个因素的交互作用，当接种量介于5%～11%时，AFB1脱除率可达到最高点，且接种量与料液比的交互作用显著。图6（a）、6（d）、6（e） 反映了温度与其他3 个因素的交互作用，当温度介于28～37 ℃时，AFB1脱除率可达最高点，且温度与时间、料液比的交互作用显著。图6（b）、6（d）、6（f） 反映了时间与其他3 个因素的交互作用，当时间介于54～72 h 时，AFB1脱除率可达到最高点，且时间与温度、料液比的交互作用显著。图6（c）、6（d）、6（f） 反映了料液比与其他3 个因素的交互作用，当料液比介于1.2～1.8 时，AFB1脱除率可达到最高点，且料液比与其他3 个因素交互作用均显著。

表5 总AFT 脱除率回归模型方差分析

图7（a） -7（f） 反映了四因素两两交互作用，当接种量5%～11%，温度28～34 ℃，时间54～63 h，料液比1.4～1.6 时，总AFT 脱除率可达最高点。等高线中心点均在上述条件范围内，总AFT 脱除率可达70%以上。

2.2.4 响应面最优条件的确定

运用Design Expert 10 软件分析得最优脱除毒素的条件为接种量9.28%，发酵温度31.80 ℃，发酵时间63.30 h，料液比1∶1.56。此条件下预测的AFB1脱除率为95.99%，总AFT 脱除率为71.48%。在此条件下进行黑曲霉生物发酵花生粕，重复试验3 次，得到AFB1脱除率（95.01%±0.50%），含量降至0.95 μg/kg，总AFT 脱除率为（72.90%±0.35%），含量降至26.80 μg/kg。与理论值相对误差分别为1.03%，1.95%，说明该优化条件可行，具有实际应用价值。

3 结论

利用黑曲霉FS10 生物发酵花生粕，研究了接种量、料液比、发酵时间、发酵温度4 个因素对花生粕中AFB1，AFB2，AFG1，AFG2脱除效果的影响，运用响应面法优化上述4 个条件对AFB1和总AFT 毒素脱除效果，研究结果表明，在接种量9.28%，发酵温度31.80 ℃，发酵时间63.30 h，料液比1∶1.56 的条件下，花生粕中的AFB1脱除率为95.01%，总AFT 脱除率为72.90%，通过对发酵条件的优化发现该黑曲霉对4 种黄曲霉毒素的脱除有着显著的效果，发酵后花生粕中AFB1含量不仅符合国内标准，也符合欧盟制定标准（＜2 μg/kg）[23]，使花生粕有成为一种低脂高蛋白农产品资源的潜力。