百合多糖提取及其止咳作用研究

孙国威，米 雪，周彦军，魏孔斌，王 雅，马文芳，李 军

（1.兰州十百农业生物科技有限公司，甘肃兰州 730022；2.陕西科技大学，陕西西安 710021；3.兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000；4.兰州市七里河区农业产业化办，甘肃 兰州 730050；5.兰州理工大学，甘肃 兰州 730050）

0 引言

百合是百合科百合属植物，百合植物的鳞茎既可食用、也可药用，是我国首批的药食两用植物之一[1]。百合营养丰富，其鳞茎主要含有多糖、皂苷、生物碱、黄酮、多酚等生物活性物质，另外还含有一些蛋白质、脂肪酸、维生素、必需氨基酸和必需微量元素等基本营养物质[2]。因此，既可利用其药用价值，也可以发挥其营养保健功能。

百合多糖是其主要功能性成分之一，药理研究证明，其具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化、抑菌等[3-6]生理功能。以兰州百合鳞茎为原料，采用酶解辅助法从百合中提取粗多糖，并进行百合粗多糖止咳作用研究，最大限度地提高百合利用率，提高百合附加值，为百合的进一步开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

百合干片，甘肃省轻工科学研究所提供；复合酶，和氏璧生物技术有限公司提供。

无水葡萄糖、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、无水亚硫酸氢钠、氨水等，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DHG-9030 型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；AL204 型电子分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司产品；HH-4 型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司产品；RE52CS-1 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；FDU-1200 型冷冻干燥机，上海爱郎仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

将百合干片粉碎，装袋备用。

1.3.2 百合多糖提取

5 g 百合干片→粉碎→脱脂→干燥→称质量→复合酶法提取→灭酶→抽滤→蒸发浓缩→醇沉→冷冻干燥→称质量→密封保藏。

1.3.3 单因素试验设计

酶添加量的选择：固定料液比1∶15（g∶mL），提取时间30 min，提取温度50 ℃，分别考查酶添加量在3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，5.0%的条件下对百合粗多糖得率的影响；料液比的选择：固定酶添加量4%，提取时间30 min，提取温度50 ℃，分别考查料液比在1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35（g∶mL） 的条件下对百合粗多糖得率的影响；提取时间的选择：固定酶添加量4%，料液比1∶15（g∶mL），提取时间30 min，分别考查提取温度在30，40，50，60，70 ℃的条件下对百合粗多糖得率的影响；提取温度的选择：固定酶添加量4%，料液比1∶15（g∶mL），提取温度50 ℃，分别考查提取时间10，20，30，40，50 min 的条件下对百合粗多糖得率的影响。每组试验重复3 次。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，固定酶添加量为4%，选择提取温度、提取时间和料液比3 个因素，采用Design Expert 8.0.6 软件进行三因素三水平的Boxbehnken 中心组合试验设计。

Box-behnken 试验设计因素与水平设计见表1。

表1 Box-behnken 试验设计因素与水平设计

1.3.5 百合多糖止咳作用研究

（1） 百合多糖对SO2引咳小鼠的止咳作用。24 只小鼠雌雄各半，随机分成4 组：空白组、阳性对照组（可待因30 mg/kg/d）、百合粗多糖高、低剂量组（40，20 mg/kg/d），各组均灌胃给药，每日1 次，连续7 d，其中空白组给予等体积生理盐水。于末次给药1 h 后，用50%浓硫酸5 mL，滴加至盛有0.5 g 无水亚硫酸氢钠的平板上，立即将1 L 的玻璃烧杯倒扣在平皿上，烧杯内随即产生SO2气体。然后迅速将各组小鼠分别放入烧杯内，观察并记录小鼠的咳嗽潜伏期（小鼠放入至出现咳嗽的时间），以及开始咳嗽后3 min 内的咳嗽次数，其中以小鼠出现明显的张口喘息为咳嗽指标。

（2） 百合多糖对氨水引咳小鼠的止咳作用。24 只小鼠雌雄各半，随机分成4 组：空白组、阳性对照组（可待因30 mg/kg/d）、百合粗多糖高、低剂量组（40，20 mg/kg/d），各组均灌胃给药，每日1 次，连续7 d，其中空白组给予等体积生理盐水。于末次给药1 h 后，将小鼠分别置于1 L 倒置的玻璃烧杯中，通过雾化器从烧杯底部小口处通入25%的氨水15 s，观察并记录小鼠的咳嗽潜伏期（小鼠放入至出现咳嗽的时间），以及开始咳嗽后3 min 内的咳嗽次数，其中以小鼠出现明显的张口喘息为咳嗽指标。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 酶添加量对百合多糖得率的影响

酶添加量对百合多糖得率的影响见图1。

随着酶添加量的增加，复合酶与底物的接触面积增加，致使多糖能够更快地分离出来，当酶添加量大于4%时，得率上升趋势逐渐趋于平缓，说明酶添加量达到4%时，酶与底物的反应逐渐趋于饱和，再增加酶的添加量，得率变化反而不大。因此，酶的最适添加量为4%。

2.1.2 提取温度对百合多糖得率的影响

提取温度对百合多糖得率的影响见图2。

酶都需要在最适温度条件下才能表现出较高的活性，由图2 可知，百合多糖得率随着温度的增长不断升高，在50 ℃时得率达到最大21.2%，说明此时可能是复合酶的最适温度，但之后随着温度的升高，复合酶活力逐渐降低，直至失活，百合多糖得率也逐渐降低。因此，最适酶解温度为50 ℃。

2.1.3 提取时间对百合多糖得率的影响

提取时间对百合多糖得率的影响见图3。

由图3 可知，百合多糖得率随酶解时间的延长而增加，当酶解时间超过30 min 时，百合多糖得率开始下降。酶解时间太短，反应不充分，多糖不能充分溶出，而当酶浓度达到一定值时，随着酶促时间延长，并不能增加多糖的得率，反而会使得率下降。因此，最佳提取时间为30 min。

2.1.4 料液比对百合多糖得率的影响

料液比对百合多糖得率的影响见图4。

由图4 可知，料液比在1∶15～1∶35 时，随着料液比的增加，百合多糖得率逐渐增大，但当料液比达到1∶25（g∶mL） 时，多糖得率开始呈下降趋势，可能是由于料液比增大，酶与底物的接触减小，酶解效果变差造成的。因此，最佳料液比为1∶25（g∶mL）。

2.2 百合多糖提取工艺的优化

2.2.1 Box-behnken 中心组合试验设计及结果

选取料液比（A）、提取时间（B）、提取温度（C） 进行三因素三水平共17 组Box-behnken 响应面分析试验。

Box-behnken 中心组合设计试验及结果见表2。

表2 Box-behnken 中心组合设计试验及结果

2.2.2 回归模型的建立及显著性分析

利用Design Expert 8.0.6 软件对百合多糖提取试验结果进行多元回归拟合，得到以百合多糖得率为目标函数的二次回归方程为：

响应面数据分析见表3。

表3 响应面数据分析

由表3 可知，模型的p＜0.001，表示回归方程差异极显著，失拟项p 值为0.347 7，不显著，说明该模型能够很好的拟合试验数据。回归方程决定系数R2=0.964 9，调整决定系数R2Adj=0.919 8，表明回归方程具有较好的拟合度。料液比的一次项达到了显著水平，提取温度的一次项达到了高度显著。影响因素由大到小顺序为提取温度＞料液比＞提取时间。此外，料液比和提取时间的交互作用，提取时间和提取温度的交互作用也达到了显著水平。料液比、提取时间和提取温度的二次项均达到了高度显著。

2.2.3 响应面优化分析

响应面曲面图和等高线图由Design Expert 8.0.6软件绘制。

各因素交互作用对百合多糖得率影响的响应面和等高线图见图6。

经Design Expert 软件优化，响应面优化模型预测百合多糖最佳提取工艺条件为料液比1∶25.57（g∶mL），提取时间30.92 min，提取温度53.79 ℃。理论计算百合多糖的最佳得率为24.04%，考虑到实际操作的可行性和方便性，将最佳工艺参数调整为料液比1∶26（g∶mL），提取时间31 min，提取温度54 ℃，并在该条件下进行平行3 次验证试验，实际测得的得率为23.80%，预测值误差为1.0%。

2.3 百合粗多糖对SO2 致咳小鼠的止咳作用评价

百合粗多糖对SO2引咳小鼠的影响（X±SD） 见表4。

表4 百合粗多糖对SO2 引咳小鼠的影响（X±SD）

由表4 可知，与空白对照组相比，高剂量百合粗多糖可显著延长SO2致咳小鼠的咳嗽潜伏期（p＜0.05）、明显减少咳嗽次数，咳嗽抑制率为25.8%，止咳活性为46.5%。表明百合粗多糖具有一定的止咳作用。

2.4 百合粗多糖对氨水致咳小鼠的止咳作用评价

百合粗多糖对氨水引咳小鼠的影响（X±SD） 见见表5。

表5 百合粗多糖对氨水引咳小鼠的影响（X±SD）

由表5 可知，与空白对照组相比，高剂量百合粗多糖可显著延长氨水致咳小鼠的咳嗽潜伏期（p＜0.05）、减少咳嗽次数（p＜0.05），咳嗽抑制率为37.8%，止咳活性为67.2%。表明百合粗多糖具有一定的止咳作用。

3 结论

响应面法优化出百合多糖提取的最佳工艺条件为料液比1∶26（g∶mL），提取时间31 min，提取温度54 ℃。进行3 次验证试验，实际测得得率为23.80%，与理论计算的百合多糖最大得率进行比较，误差仅为1%，说明该模型具有实际应用价值。百合粗多糖对小鼠止咳试验结果：与空白对照组相比，百合粗多糖高剂量组能够延长小鼠咳嗽潜伏期，缩短3 min 内小鼠的咳嗽次数，作用效果略低于阳性对照组。说明百合粗多糖可以改善咳嗽症状，具有止咳作用。