黑曲霉固态发酵香蕉皮产果胶酶的培养基条件研究

韦璐　唐婷　宁恩创

摘要：为研究开辟香蕉资源综合利用新途径，以香蕉皮及麸皮为主要原料，黑曲霉CICC40493为发酵菌种，采用单因素和正交试验，研究确定固态发酵果胶酶的基础培养基配比。结果显示，果胶酶最适基础培养基为：香蕉皮渣3g、麸皮7g、硫酸铵0.45g、水15mL；影响酶活力的主次顺序为：麸皮和香蕉皮渣配比>硫酸铵添加量>去离子水添加量，最佳配比的培养基在自然pH值，装瓶量10g干料/250mL三角瓶，接种量1.0mL的条件下，28℃恒温培养72h，获得的果胶酶总活力为10853.54U。试验结果表明利用香蕉皮接种黑曲霉CICC40493固态发酵生产果胶酶是可行的，为开辟香蕉资源综合利用新途径的研究提供数据支持。

关键词：香蕉皮；固态发酵；黑曲霉；果胶酶

中图分类号：TS201.4 文献标识码：A 文章编号：1003-4374（2015）06-0025-04

Abstract： To prepare banana peel and wheat bran as main raw materials， Aspergillus Niger CICC40493 as fermentation， and then to adopt single factor and orthogonal experiments determine mixture ratio of solid-state fermentation pectinase basic culture medium. The result showed that the optimum culture medium for pectinase was as follow： banana peel 3g， bran 7g， ammonium sulfate 0.45g， deionized water 15mL；The primary and secondary sequence of the enzyme activity was the ratio of banana peel and wheat bran>addition of ammonium sulfate>addition of deionized water， the optimal proportion of medium was fermented in the following conditions： natural pH， bottling capacity 10g drier/250mL triangle bottle， inoculation 1.0mL， 28℃ as fermentation temperature，and 72 hours as fermentation time， then， experimenter would get the total activity pectinase was 10853.54U. The result showed that producing pectinase by the banana peel inoculated with solid state fermentation of Aspergillus niger CICC40493 was feasible.

Key words： Banana peel； solid state fermentation； aspergillus niger； pectinase

香蕉是一种营养丰富，价格低廉的典型热带经济作物，广泛种植于我国的广西、广东等华南地区[1，2]。香蕉皮则是香蕉在深加工过程中产生的主要废弃物，约占香蕉总质量的30%-40%[3]，因此开展以香蕉皮作为原料进行深加工的研究对香蕉的综合利用、提高产业附加值及保护环境都具有重要的意义。在前期对香蕉皮中主要营养成分的测定中发现，香蕉皮中总糖、蛋白质、果胶含量尤其丰富，可提供给微生物发酵所需的碳源、氮源，其中果胶质还可以作为发酵生产果胶酶的诱导物。

果胶酶是世界四大酶制剂之一，能降解果胶质，广泛应用于食品、医药、纺织和环保等领域等行业中，在全世界食品酶的销售额中占25%[4-7]。微生物是生产果胶酶的优良生物资源，在果胶酶的工业化生产中以霉菌最为常见[8，9]。通过查阅文献发现，目前在果胶酶的发酵制备中，已经有利用苹果渣、菠萝渣、橘皮渣等富含果胶的农产品加工副产物做发酵原料生产果胶酶的报道[10-12]，但利用黑曲霉作为发酵菌种，香蕉皮和麸皮作为发酵主料的研究还不多见。

文章采用单因素及正交试验开展了以香蕉皮和麸皮作为主要原料，黑曲霉CICC40493为发酵菌种，采用单因素试验和正交试验进行固态发酵，确定基础培养基的配比，为开辟香蕉资源综合利用的新途径提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验原料

香蕉：购于广西南宁西乡塘市场，烘干后打碎，过400目筛，备用。

麸皮：购于广西南宁西乡塘市场，过400目筛，备用。

1.2 试剂

考马斯亮蓝G250、磷酸、氢氧化钠、盐酸、硫酸铵、90%乙醇、乙酸、乙酸钠、酒石酸钾钠、3-5二硝基水杨酸钠、苯酚、无水亚硫酸钠、冰醋酸，均为国产分析纯；果胶标准、半乳糖醛酸标准、牛血清蛋白标准，sigma公司产；黑曲霉CICC40493中国工业微生物菌种保藏中心。

1.3 仪器

VIS-7220N紫外-可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；T500型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；1010-3型电热鼓风干燥箱，上海实验仪器厂有限公司；HH-S数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；KQ-600DV型数控超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司；3H16RI冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；DNP-9272型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；PL203型分析天平，梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；KEDA-A6智能版通风柜，深圳申立；yxq-ls-100sll高压灭菌锅，上海博迅实业有限公司。

1.4 培养基及培养条件

菌种保存与三角瓶扩大培养采用PDA培养基。培养条件：28℃恒温培养120h，斜面菌种及三角瓶扩大培养菌种置于5℃冰箱保存。

固态发酵基础培养基：一定比例的干香蕉皮与麸皮混合（总量为10g），加入一定量的硫酸铵和去离子水搅拌均匀，装入250mL三角瓶瓶中，121℃湿热灭菌40min。培养条件：自然pH值下，装瓶量10g干料/250mL 三角瓶，接入1.0mL的黑曲霉CICC40493孢子悬浮液（菌悬液A430nm=0.05，孢子数为5×105个/mL菌液），28℃恒温培养72h。培养过程中于12h、24h、36h各摇瓶一次。

1.5 实验方法

1.5.1 黑曲霉CICC40493孢子悬浮液的制备 取已培养好的三角瓶菌种一瓶，加入50mL无菌的质量分数为0.85%的生理盐水，轻轻将培养基表面的孢子刮下，将孢子悬浮液置于已灭菌的三角瓶中，瓶中预先放入数粒无菌玻璃球，充分振摇后用无菌脱脂棉过滤制备成孢子悬浮液。

1.5.2 粗酶液的制备 发酵完毕后，往三角瓶中加入80mL纯水，开启超声波提取器进行提取（提取温度32℃，超声波功率70%，提取1h），提取完毕后4000r/min冷冻离心10min，取上清液即为果胶粗酶提取液，测定提取液中的蛋白质含量及果胶酶活力。

1.5.3 酶活力的测定 DNS显色法[13]。以半乳糖醛酸含量为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，得到线性回归方程y=0.5099x-0.0503，R2=0.9932。果胶酶活单位定义为：1g固体酶粉（1mL液体酶）在40℃±0.5℃ pH 4.8条件下，每分钟水解底物产生1μg半乳糖醛酸所需酶液的量定义为一个果胶酶活性单位，以U表示。

1.5.5 单因素试验

（1）麸皮和香蕉皮的配比对果胶酶活力的影响。麸皮、香蕉皮分别以质量比9：1，8：2，7：3，6：4，5：5比例混合（麸皮，香蕉皮总量为10g），固定硫酸铵添加量0.45g，纯水12mL，培养基配比好后，按照1.4的方法进行培养，培养结束后按1.5.2的步骤制备粗酶液，测定粗酶液中的蛋白质含量及果胶酶活。

（2）硫酸铵添加量对果胶酶活力的影响。固定麸皮、香蕉皮的质量比为7：3（麸皮，香蕉皮总量为10g），纯水12mL，分别添加0.25、0.35、0.45、0.55、0.65g的硫酸铵，培养基配比好后，按照1.4的方法进行培养，培养结束后按1.5.2的步骤制备粗酶液，测定粗酶液中的蛋白质含量及果胶酶活。

（3）蒸馏水添加量对果胶酶活力的影响。固定麸皮、香蕉皮的质量比为7：3（麸皮，香蕉皮总量为10g），硫酸铵0.45g，分别添加8、10、12、14、16mL的去离子水，培养基配比好后，按照1.4的方法进行培养，培养结束后按1.5.2的步骤制备粗酶液，测定粗酶液中的蛋白质含量及果胶酶活。

1.5.6 正交试验 在单因素试验结果上，设计了3因素3水平的正交试验，因素水平设计见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 麸皮和香蕉皮的配比对果胶酶活力的影响 麸皮和香蕉皮的配比对果胶酶活力及蛋白质的影响见图1，呈先上升后下降的趋势，果胶酶的活力和蛋白质的含量变化趋势基本一致，从菌丝的生产情况来看，当两者的比例低于5：5时候，菌丝基本不生长，麸皮越多发酵过程中菌丝生长得越多，但酶活力不一定越高。试验结果表明：适当的添加香蕉皮有利于菌丝在生长过程中果胶酶的合成，这是由于一方面香蕉皮中含有果胶物质，可以作为微生物发酵产果胶酶的诱导物，但是香蕉皮中还含有较多的单宁，对霉菌的生产也会有一定的抑制作用，因此适当的麸皮与香蕉皮的配比对果胶酶产出的影响较大，从图中可以看出，当麸皮和香蕉皮的比例为7：3时，产出的果胶酶活力最高，总酶活达到6122.77U。

2.1.2 硫酸铵添加量对果胶酶活力的影响 硫酸铵是微生物培养基中常用的无机氮源，在发酵初期首先被消耗掉，消耗的过程会提高培养基的pH值，试验中干香蕉皮中总酸含量达到3.2%，会降低培养基的pH值，而硫酸铵的加入会起到调剂pH值的作用。黑曲霉的最适合生长pH在6.0-6.5左右。从实验结果（见图2）可以看出，当固定麸皮、香蕉皮的质量比为7：3（两者总量为10g），去离子水12mL的时候，添加0.35g的硫酸铵产出果胶酶的活力最大，总酶活为10812.37U。

2.1.3 水添加量对果胶酶活力的影响 水分是培养基中营养物质和微生物代谢产物的优良媒介，试验所用的菌种为霉菌属，喜欢生长在温暖潮湿的环境中，因此本试验把水的添加量也作为影响果胶酶产出的主要因素进行研究，试验结果见图3，随着培养基中水分的升高，果胶酶的活力及蛋白质的含量也呈升高的趋势，这说明充足的水分有利于黑曲霉在发酵过程中合成各种酶，从图可以看出，当固定麸皮、香蕉皮的质量比为7：3（两者总量为10g），硫酸铵添加0.35g时，添加14mL的水，产出果胶酶的活力最高为6912.54U。

2.2 正交试验结果

正交试验进一步优化培养基基本组成，在单因素试验基础上进行了3因素3水平的正交试验，试验结果见表2，由均值可知，理论上最佳的培养基组合为A3B2C3，即麸皮和香蕉皮配比为7：3（两者总量为10g），硫酸铵添加量为0.45g，蒸馏水添加量为15mL，在该条件下做验证试验，试验平行3次，获得果胶酶活力的平均值为10853.54U。由极差值可知，影响果胶酶酶活力因素的主次顺序为：麸皮和香蕉皮配比>硫酸铵添加量>水添加量。方差分析可知（见表3）在实验设计的范围内，麸皮和香蕉皮的配比对果胶酶活力具有显著的影响，硫酸铵和水的添加量则影响不显著。

3 讨论

香蕉皮是香蕉深加工过程中的主要废弃物，研究发现香蕉皮中不仅含有适合微生物生长的营养成分，如糖分、蛋白质、维生素、矿物质等，还含有产果胶酶的诱导物果胶质，但同时也含有抑制微生物生长的单宁等成分，因此在研究其发酵产果胶酶的培养基基本组成时，香蕉皮与麸皮的配比对产果胶酶的影响显得尤为重要，实验结果也证明了两者的比例对果胶酶活力的影响最为显著，同时也证明了用香蕉皮作为微生物固态发酵产果胶酶在技术上具有可行性。香蕉作为在市场上普遍销售的一种水果，具有量大且价格低廉等特点，因此，利用香蕉皮发酵生产果胶酶一方面可大幅度降低生产成本，一方面还可以解决香蕉皮的综合利用问题。

4 结论

用香蕉皮及麸皮为主要原料，黑曲霉CICC40493为发酵菌种，采用单因素和正交试验确定生产果胶酶的基础培养基的配比为：香蕉皮3g、麸皮7g、（NH4）2SO4 0.45g、水15mL；影响香蕉皮产果胶酶酶活力因素的主次顺序为：麸皮和香蕉皮配比>硫酸铵添加量>去离子水添加量；最佳配比的培养基在自然pH值下，培养基装瓶量10g干料/250mL三角瓶，接种量1.0mL（菌悬液A430nm=0.05，孢子数为5×105个/mL菌液），28℃恒温培养72h，所产果胶酶酶总活力可达10853.54U。试验结果表明利用香蕉皮接种黑曲霉发酵生产果胶酶是可行的。

参考文献：

[1] 赵肃清，孙远明，蔡燕飞，等. 香蕉皮黑色素的鉴定及其抗氧化作用研究[J]. 中草药，2002，33（6）：496-498.

[2] 徐云升，宋维春.香蕉皮制备多功能膳食纤维添加剂的研究[J].食品工业科技， 2005， （11）： 14.

[3] 闫文杰，李鸿，艾秋实，等.香蕉和香蕉皮的加工利用[J].中国食物与营养，2008，（12）：30-32.

[4] Kapoor M，Beg QK，Bhushan，et a1.Production and partial purificationand characterization of a thermo-alkali stable polygalachuronasefrom Bacillus sp，MG-CP-2 [J].Process Blochemistry， 2000，（36）：467-473.

[5] 李祖明，张洪勋，白志辉，等.微生物果胶酶研究进展[J].生物技术通报，2010，（3）： 42-49.

[6] 吴振强，梁世忠.糖蜜酒精蒸馏废液色素研究[J]. 环境污染与防治，2002，24（1）：14-18.

[7] Kashyap DR，Vohra PK，Chopra S，et al. Applicaions of pectinasesin the commercial sector：areview[J].Bioresource Technology，2001，（77）：215-227.

[8] Gummadi SN，Panda T. Purification and biochemical properties ofmicrobial pectinases： a review[J].Process Blochemistry，2003，（38）：987-996.

[9] JayaniR. S， Saxena S， Gupta R. Microbial pectinolytic enzymes：A review[J]. Process Biochem istry， 2005，（40）： 2931-2944.

[10] 邓毛程，王瑶，李胜.黑曲霉利用菠萝皮培养基发酵产果胶酶的研究[J].中国酿造，2009，（7）：106-109.

[11] 姜心，陈伟，周波.苹果渣固态发酵产复合酶培养基优化的研究[J].山东农业科学，2010，（1）： 80-85.

[12] 林华娟，秦小明，张初署，等.菠萝渣生产果胶酶的研究[J].食品科技，2009 ，（5）：70-72.

[13] 王天龙，仇宏伟，陈海华，等.3，5-二硝基水杨酸法测定果胶酶活力的条件研究[J].食品与机械，2008，24（3）：96-104.

[14] 黄婉玉， 曹炜， 李菁，等.考马斯亮蓝法测定果汁中蛋白质的含量[J].食品与发酵工业，2009，35（5）：160-162.