芽孢杆菌糖代谢操纵子及其阻遏机制

摘要：葡萄糖作为一种速效碳源，是大多数工业微生物包括芽孢杆菌优先利用的碳源。其分解代谢物会抑制其他糖代谢相关的基因表达，从而无法利用非速效碳源，这种现象被称为碳代谢物阻遏效应，是细菌应用于工业化生产的一大难题。这种效应在革兰氏阳性细菌中主要是由CcpA蛋白调控的。本综述介绍了目前对这一现象的认识及未来的研究方向。

关键词：芽孢杆菌；糖代谢；阻遏机制

芽孢杆菌（Bacillus）为革兰氏阳性原核细菌，普遍存在于自然环境中。在土壤、哺乳动物的粪便、农产品、鸟类羽毛中是占据主导优势的微生物。由于生存环境多变且差异较大，细胞均由复杂的代谢调控网络来适应各种不良条件，如高温、饥饿、酸碱、化合物变化引起的渗透压变化等。不仅如此，芽孢杆菌还可以形成芽孢来抵御恶劣的生存环境，在生存条件恶劣、营养条件缺乏时，细胞内会形成抗逆性强的芽孢休眠体，一旦转至营养丰富的环境中，处于休眠状态的菌群会迅速繁殖，重新长成一个细菌。

芽孢杆菌由于其酶系丰富，生长速率适中，蛋白折叠充分，具有很多其他工业菌种没有的优势，被作为同源或异源表达的平台，是优良的工业微生物菌株，在世界上被广泛应用于生产淀粉酶、碱性蛋白酶和某些抗生素。其中地衣芽孢杆菌是嗜温菌，在40-50℃下仍能较好的生长；在发酵过程中可以分泌肽类物质抑制其他细菌、真菌的生长，因此不易染菌；该菌自身酶系比较丰富、酶的产量比其他水平较高，其胞外蛋白分泌量可达枯草芽孢杆菌的2.4-2.6倍；该菌被称为整肠生，因其对氧气需求量高，可以在人、动物的肠道中迅速夺取氧气，以保证肠道中厌氧菌群的平衡，从而维护肠道的生态平衡；此外，该菌被认定为食品安全级菌株 （Generally Recognized As Safe，GRAS），至今已有40多年的历史。

尽管存在这些优势，地衣芽孢杆菌中仍有很多未知的特性有待考察，其潜力仍需继续挖掘。地衣芽孢杆菌主要分泌的酶是生长相关酶，如蛋白酶和淀粉酶，但这种其适应自身生长的机制并不适用于酶生产的工业过程。对于工业生产来说，菌株应以最低的资源消耗包括最低的生物量的积累最大限度地增加酶的表达。野生型地衣芽孢杆菌自身会在生长后期表达多种蛋白酶基因，其中编码胞外碱性丝氨酸蛋白酶基因 （aprE）最为常见。而其分泌至特质制培养基中的蛋白酶，可能会对已表达的目标蛋白产生一定的降解作用。此外，还有报道指出，当地衣芽孢杆菌作为宿主进行外源蛋白的表达时，还存在着产量低等问题。比如本研究采用的是α-淀粉酶基因作为报告基因，而α-淀粉酶是对菌体本身有一定毒性的。

地衣芽孢杆菌在工业化生产上的应用，主要是采用组成型表达机制来合成其内源性代谢产物。一方面，组成型表达机制适用于宿主内源基因的高效表达，且不需要添加诱导剂；但另一方面，其表达量受菌体生长影响，不易控制，在生长早期，目标蛋白的大量表达对细胞生长有不利影响，所以当表达的目的蛋白对菌体有害时，其可能会影响菌体的正常生长代谢，甚至毒害菌体而威胁菌体生存，以致蛋白的表达量极低。由于当前对该菌株诱导表达系统的认识仅停留在解除效应物阻遏的开关机制，其在发酵过程中的各类影响因素尚不清楚，所以地衣芽孢杆菌在应用上不如已被充分研究的大肠杆菌和酵母，其优势尚未良好地发挥。诱导表达系统将酶的生产与细胞生长分开，可以解决上述的这些问题，开发各种诱导表达系统可以大大拓宽这种优势菌种的应用范围。

1. 木糖操纵子的特性

在对芽孢杆菌研究的过程中发现它可以利用木糖，进一步在其胞内发现了木糖运输系统及代谢途径。地衣芽孢杆菌中存在的木糖运输途径为ABC运输系统：以水解ATP得到的能量作为运输动力，通过与木糖专一性结合的介导蛋白完成运输。木糖进入枯草芽孢杆菌细胞内，在木糖异构酶（XylA）的作用下转变为木酮糖，在木酮糖激酶（XylB）的催化作用下，进一步生成5-磷酸-木酮糖，5-磷酸-木酮糖经由磷酸戊糖途径进入糖代谢途径。

目前，研究较为透彻的木糖操纵子有两种，分别来源于枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。D-木糖操纵子位于大肠杆菌染色体glyS位点附近，XylA的结构基因编码440个氨基酸，另外还有XylB、XylT和XylR三个读码框。大肠杆菌两个启动子PA、PF的转录翻译均受木糖诱导，同时也受葡萄糖降解的抑制。XylR本身带有弱启动子且处于xylF（木糖结合蛋白基因）、xylG（ATP结合蛋白基因）、xylH（木糖转运蛋白基因）下游，不受木糖和葡萄糖降解的调控，xylR生产的阻遏蛋白能够正向调节xylAB的表达。枯草芽孢杆菌的xyl操纵子位于染色体168度，属于强启动子。xylR位于染色体162度，该基因编码木糖启动子的阻遏蛋白，与xylA相邻但转录方向正好相反。枯草芽孢杆菌木糖操纵子有两个调控元件OL和OR，这两个调控元件相互串联并交错重叠，阻遏蛋白能同时分别与这两个调控元件结合，实现对xyl操纵子的负调控。添加木糖后，阻遏蛋白从与xylO的复合物中分离，从而使xylA、xylB一系列基因得以转录。经研究发现，葡萄糖和果糖的存在会抑制木糖的诱导作用；而葡萄糖-6-磷酸会使XylR与xylO结合更紧密，是一种輔阻遏物。此外，xyl操纵子还受CCR效应的影响：在葡萄糖与木糖同时存在的条件下，微生物优先利用葡萄糖，葡萄糖耗尽时激活木糖利用基因。枯草芽孢杆菌的木糖特异性转运蛋白位于cre之后，葡萄糖存在时CcpA与cre紧密结合，从而影响木糖的利用，同样葡萄糖的存在也会影响木糖操纵子的作用。

2. 甘露糖操纵子的特性

目前已有研究的是枯草芽孢杆菌的甘露糖操纵子，该操纵子由三个基因组成，分别是manP，manA和yjdF，它们负责甘露糖的运输和利用。在上游和与甘露糖操纵子相同的方向上调节基因ManR编码甘露糖操纵子的转录激活因子。甘露糖诱导着甘露糖操纵子的转录和manR的转录。甘露糖的存在导致来自manP启动子（PmanP）的lacZ表达增加了4至7倍，来自manR启动子（PmanR）的lacZ表达增加了3倍。

D-甘露糖是一种2-二聚体葡萄糖，存在于甘露聚糖和异甘露聚糖多糖、糖蛋白和许多其他糖结合物中。许多细菌可以使用D-甘露糖作为碳源。在枯草芽孢杆菌中，甘露糖分两步进入碳水化合物代谢。首先，它通过甘露糖特异性PTS转运体在摄取过程中磷酸化到甘露糖-6-磷酸。其次，通过甘露糖-6-磷酸异构酶将其转化为果糖-6-磷酸。甘露糖操纵子中的三个基因已经被鉴定。第一个基因manP编码一个假定的PTS甘露糖特异性酶IIBCA组分（转运蛋白），它与支原体的果糖特异性过氧化物酶具有明显的序列相似性，因此属于Fru过氧化物酶家族。第二个基因manA编码甘露糖-6-磷酸异构酶，而第三个基因yjdF的功能尚不清楚。据推测，上游和与甘露糖操纵子相同的方向是一个调节基因manR编码甘露糖操纵子的激活物。利用蛋白质序列比对N端DNA结合基序，鉴定出两个PRDs和一个EIIAEII B结构域，表明manR是一种含有PRD的激活剂，类似于嗜硬脂菌的MTLR。

3. 地衣芽孢杆菌中鼠李糖操纵子的特性

鼠李糖操纵子作为一种诱导表达元件，在地衣芽孢杆菌中可以用来介导异源基因的表达。地衣芽孢杆菌中的鼠李糖启动子，是由六个结构基因和一个启动子（ori）组成，其结构基因分别为转醛酶（rhaA），鼠李糖脱氢酶（rhaD），鼠李糖转运蛋白（rhaB，rhaC，rhaE）和激活蛋白（rhaM）。转运蛋白基因rhaB，rhaC，rhaE分别编码鼠李糖PTS系统中的蛋白EIIC、EIIB和EIIA，负责转运鼠李糖。

糖特异性膜结合酶I I复合物（EII），起到了特定糖的运输和磷酸化作用。EII复合物通常由三个功能域组成，融合在单个蛋白或被分离的蛋白质上，其中IIA域（以前称为EIII）和IIB域分别具有第一和第二磷酸化位点，而IIC域形成跨膜通道和糖结合位点。rhaM基因表达的是一种DNA结合蛋白，已被证明是激活操纵子所必需的蛋白。

4. CcpA蛋白的作用机理

4.1 碳代谢阻遏（CCR效应）

Jacques Monod等人在1942年观察到，大肠杆菌E. coli在葡萄糖和半乳糖同时作为碳源的情况下，大肠杆菌会优先利用葡萄糖作为能源物质，当葡萄糖消耗后才开始利用半乳糖，即菌体的二次生长现象。之后许多研究结论表明，当葡萄糖存在时，其分解代谢物会抑制与其他糖代谢相关的基因表达，从而利用速效碳源，这种现象被称为碳代谢物阻遏（CCR）效应。这种现象在细菌中普遍存在，是细菌应用于工业化生产的一大难题。而这种效应主要依赖于CcpA蛋白。

CCR效应的组成部分为一个特有的顺式活性序列（cre位点：catabolite responsive element分解代谢反应元件）和一种反式作用蛋白（CcpA蛋白：catabolite control protein代谢控制蛋白），CcpA蛋白识别并与cre元件相互作用以负性调节相应基因的转录。芽孢杆菌中的典型cre序列已被确定为TGWAANCGNTNWCA，其中N代表任意碱基，W代表碱基A或者碱基T。这种结合序列通常存在与许多与碳代谢相关的基因的N末端序列处。

4.2 CcpA蛋白作用机制

CcpA是一种转录调控因子，与芽孢杆菌中某些非速效碳源代谢基因如木糖操纵子、甘露醇操纵子、山梨醇操纵子上的特定位点结合进而控制该基因的表达。早在1995年，Kim等人已在枯草芽孢杆菌中，通过足迹法和凝胶迁移阻滞（EMSA）实验证明了CcpA蛋白可以在共阻遏物P-（Ser）-Hpr不存在的情況下与淀粉酶编码基因amyE启动子区域处的cre位点amyO结合。但之后的相关研究表明，在多数情况下，CcpA蛋白和cre位点的结合是需要共阻遏蛋白参与的。共阻遏HPr蛋白（histidine-phosphoryl protein）有两个磷酸化位点：组氨酸残基和丝氨酸残基。该蛋白的HPr蛋白的丝氨酸残基随后在Hpr 激酶/磷酸酯酶（HPrK/ P：Hpr kinase/phosphoesterase）的催化下被磷酸化，形成P-（Ser）-HPr，并与转录调控因子CcpA形成复合体，而组氨酸残基在磷酸转移酶系统（PTS ：phosphotransferase system）中的酶I（EI：enzyme I）催化下以磷酸烯醇式丙酮酸（PEP： phosphoenolpyruvate）为底物进行磷酸化，并将磷酸基传递给负责葡萄磷酸化和糖转运的PTS系统；参与CCR效应。

HPrK/P的活性受胞内能荷水平（ATP/Pi）以及葡萄糖代谢产物比如1，6-二磷酸果糖（F-BP）、6-磷酸葡萄糖（G-6-P）水平的影响。当葡萄糖等速效碳源存在时，在胞内高能荷水平上升和葡萄糖代谢生成产物这两种条件下，HPrK/P的激酶活性被激活，HPr的丝氨酸残基在催化下进行磷酸化，然后P-（Ser）-HPr与CcpA结合形成复合物，然后再与非速效碳源代谢基因的cre位点结合，抑制其转录及翻译。

作者简介：

楼志华（1981.08-）男，汉族，浙江省义乌市人，硕士；职称：中级工程师；研究方向：发酵工程、生物分离纯化、酶工程。