重金属对不同地区鲈鱼酶活及性激素的相关性分析

2020-11-13刘源

农产品加工 2020年19期

刘源

（河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳 471023）

重金属污染是指重金属及其化合物对大气、水、土壤等造成的环境污染。重金属污染对海洋生物的生长与繁殖的影响日趋严重[1]，海洋中的重金属吸附于悬浮颗粒，随沉淀物沉没于水底。因此，重金属污染极难被生物降解[2-5]，且重金属经过生物的富集的作用，通过食物链进入人体，并对人体造成一系列的健康问题。随着我国居民生活水平的提高，海洋鱼类也成为了餐桌上必不可少的食物，而鲈鱼又因其营养价值高、味道鲜美、肉质细嫩成为广大食客的首选鱼类。

金属硫蛋白（MT）是能与多种重金属结合的一类低分子蛋白[6]，并会对机体内的重金属含量具有调节作用，从而达到维持其在机体内的平衡目的[7-8]。GST 酶和EROD 酶是有机污染物及其化合物在体内转化过程中重要的酶，可以通过酶的活性来预测其在生物体内的污染情况[9]。近海沉淀物中的有机污染物会使EROD 酶的活性升高[10]。在某些重金属离子的胁迫作用下，可促进EROD 酶的活力，因此其可作为一个监测水体重金属污染的指标。国内外的大多数研究集中于有机污染物的影响研究，重金属与多环芳烃在不同营养级的富集是一个动态复杂的过程，多环芳烃会引起EROD 酶活性的上升，重金属对鱼类体内EROD 微粒体同样具有体内和体外的诱导作用[11]。国内外在重金属对鱼类生殖方面研究比较单一，多种金属元素与性激素的相关性研究鲜有报道，且雌二醇和睾酮的含量对鱼类性腺的发育、成熟起着重要的作用。罗永巨[12]研究发现重金属镉会使雌二醇的含量升高，在镉的胁迫作用下，罗非鱼的孵化率降低，畸形率升高。

试验研究了5 个不同地区鲈鱼体内14 种重金属的含量与MT、酶活性及性激素含量的相关性，探究了14 种重金属元素在鱼体内的富集情况与MT、酶活性及性激素含量的关系，为该地区重金属在海洋生态及海洋鱼类的污染情况提供理论数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与主要仪器

材料：于A，B，C，D，E 等5 个地区随机捕捞鲈鱼各22 条。

试剂：5,5' -二硫硝基苯甲酸（DTNB），西安赫特生物科技有限公司提供；乙二胺四乙酸二钠（EDTA），美国Sigma 公司提供；三羟甲基氨基甲烷（Tries-HCl），天津百伦斯生物技术有限公司提供；GST 酶试剂盒、EROD 酶试剂盒，上海江莱生物科技有限公司提供；E2 和T 试剂盒，上海桥杜生物科技有限公司提供。

仪器：PinAAcle 900H 型原子吸收光谱仪，美国Perkin Elmer 公司产品；Multiwave PRO 型微波消解仪，奥地利Anton Paar 公司产品；H2500R 型高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；FA1004B 型电子天平，上海精密仪表有限公司产品；680 型全自动酶标仪，美国Bio-Rad 公司产品，UV2600 型紫外可见分光光度计，日本Shimadzu 公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 样品预处理

将各地区捕捞的鲈鱼置于鱼缸中，为确保其活力，进行冲氧并分别进行编号1～22，然后运回实验室对其解剖并进行指标测定。

1.2.2 不同地区鱼体内重金属元素含量测定

称取鱼样约0.2 g 置于25 mL 的消解罐中，加入8 mL HNO3和4 mL H2O2，室温条件下消解过夜，然后在120 ℃条件下消解3 h，将消解液置于50 mL 的容量瓶中进行定容。取消解液50 μL，进行重金属的测定。该原子吸收光谱为火焰-石墨炉一体机。

1.2.3 不同地区鲈鱼体内金属硫蛋白（MT）的测定

参照严国等人[13]的方法稍作修改。称取新鲜鱼样10.000 g，剁碎，颗粒尽量细小，然后在高速均质机内均质3 次，每次1 min，取1.000 g 加入0.1 mol/L的Tris-HCl 缓冲液6 mL，在4 ℃环境下摇匀，抽提8 h；将该液体置于4 ℃下以转速12 000 r/min 离心5 min，收集上清液；于90 ℃水浴下加热3 min，降至室温，以转速12 000 r/min 离心5 min，收集上清液；加入3 mL 的无水乙醇，于-18 ℃下沉淀12 h；再以转速12 000 r/min 离心5 min；取沉淀加入0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液5 mL 溶解2 h；以转速12 000 r/min 离心5 min，收集上清液用于测定MT 含量。

1.2.4 不同地区鲈鱼体内酶活性的测定

按1.2.3 处理鱼样，取5.000 g 加入PBS 缓冲液匀浆机内匀浆，在高速冷冻离心机里以转速20 000 r/min离心10 min 后取上清液，对GST 酶和EROD 酶活性的测定按试剂盒的步骤进行测定。

1.2.5 不同地区鲈鱼血清内性激素含量测定

将称好质量的鱼肉组织，加入质量10 倍体积的PBS 缓冲溶液溶液。随后进行组织匀浆。组织匀浆好后，在4 ℃下以转速20 000 r/min 离心5 min。随后收集匀浆液的上清液。性激素的含量按上海桥杜生物科技有限公司提供的说明书进行测定。

2 结果与分析

2.1 A 地区鲈鱼体内重金属与MT，GST，EROD，E2，T 睾酮的相关性分析

金属硫蛋白易与重金属结合，在调节鱼体内重金属的平衡起着重要的作用，不同地区的重金属含量存在差异，机体的调节能力也存在个体差异。Se元素是人体必需的微量元素之一，在酸性条件下，金属硫蛋白的金属易解离出来；在中性介质下，该解离的蛋白又会与Se 结合形成类金属硫蛋白[14]。从表1 可以看出，A 地区Se 的含量与MT 呈正相关（p＜0.05），相关系数为0.51；对该地区而言，可以根据金属硫蛋白的含量大致反映出Se 在鱼体内的富集状况。性激素的含量能够体现鱼体的孵化、生长及繁殖情况，As 的含量与E2 呈极显著负相关（p＜0.01），相关系数为-0.59，可见As 的含量越高，鱼体所分泌的雌二醇越低；Zn 的含量与T 睾酮呈负相关（p＜0.05），相关系数为-0.42，重金属Zn 的含量高，则会引起睾酮的分泌量减少。A 地区重金属含量与GST 酶及EROD 酶的活性不具有相关性。

A 地区鲈鱼体内重金属与MT，GST，EROD，E2，T 睾酮的相关性分析见表1。

2.2 B 地区鲈鱼体内重金属与MT，GST，EROD，E2，T 睾酮的相关性分析

海水中的重金属大多以与悬浮的颗粒相结合的形式存在，另一方面是工业生产及人类生活产生的污染（该污染物大多是与有机物结合，形成难以分解的有机物污染物）。

表1 A 地区鲈鱼体内重金属与MT，GST，EROD，E2，T 睾酮的相关性分析

B 地区鲈鱼体内重金属与MT，GST，EROD，E2，T 睾酮的相关性分析见表2。

由表2 可知，B 地区Se 的含量与MT 呈显著正相关（p＜0.05），相关系数为0.46，可见金属硫蛋白在该地区与Se 的结合能力要强于另外13 种元素；As 的含量与EROD 酶呈显著负相关（p＜0.05）相关系数为-0.45。EROD 酶是重金属在鱼体内转化的重要酶，EROD 酶的活性越高，重金属As 的含量越低。可见，鱼体为了维持体内As 的平衡，EROD 酶通过将体内含重金属As 的污染物分解，从而排出机体外。对于B 地区而言，重金属含量与雌二醇和睾酮不存在相关性。因此，为了了解该地区鲈鱼生长状况，可对试验之外的重金属进行测定，从而确定是否存在某一重金属与雌二醇及睾酮存在相关性。

表2 B 地区鲈鱼体内重金属与MT，GST，EROD，E2，T 睾酮的相关性分析

2.3 C 地区鲈鱼体内重金属与MT，GST，EROD，E2，T 睾酮的相关性分析

C 地区鲈鱼体内重金属与MT，GST，EROD，E2，T 睾酮的相关性分析见表3。

由表3 可知，C 地区As 的含量与MT 呈显著正相关（p＜0.05），相关系数为0.44，该地区在鱼体内As 元素结合金属硫蛋白的能力最强；Sn 的含量与EROD 酶呈极显著负相关（p＜0.01），相关系数为-0.53，EROD 酶的活性越高，重金属Sn 的含量越低，因此该区域的鲈鱼对重金属Sn 在其体内的平衡具有一定的调节作用；Sn 的含量与T 睾酮呈显著负相关（p＜0.05），相关系数为-0.42，鱼体内Sn 的含量较高时，睾酮的分泌量减少，从而对鲈鱼在该区域的生长产生不利的影响；Ba 的含量与T 睾酮呈显著正相关（p＜0.05），相关系数为0.47，鱼体内Ba 的含量在较高的水平下，鲈鱼睾酮的分泌量较多。由于某些重金属之间存在的竞争机制，因而机体的生长状况要综合多方面的因素进行考量。重金属含量与GST 酶不具有相关性。

表3 C 地区鲈鱼体内重金属与MT，GST，EROD，E2，T 睾酮的相关性分析

2.4 D 地区鲈鱼体内重金属与MT，GST，EROD，E2，T 睾酮的相关性分析

D 地区鲈鱼体内重金属与MT，GST，EROD，E2，T 睾酮的相关性分析见表4。

由表4 可知，D 地区重金属Ni、Ag 和Cr 的含量与MT 呈极显著正相关（p＜0.01），相关系数分别为0.55，0.63，0.55；重金属V、Cu 和Ba 的含量与MT 呈显著正相关（p＜0.05）相关系数分别为0.51，0.44，0.51，该水域内鲈鱼体内重金属Ni、Ag 和Cr与金属硫蛋白的结合能力较强，重金属元素V、Cu和Ba 与金属硫蛋白的结合能力要弱于前3 种，重金属元素与金属硫蛋白结合能力为Ag＞Ni=Cr＞V=Ba＞Cu，其中重金属元素Ag 结合金属硫蛋白的能力最强，重金属元素Cu 的结合能力最弱；Sn 的含量与MT 显著负相关（p＜0.05），相关系数为-0.40；可见重金属Sn 的含量较高时，金属硫蛋白的含量较低。重金属Cu 的含量与EROD 酶呈显著正相关（p＜0.05），相关系数为0.43，可见重金属元素Cu 含量在一定范围内含量越高，EROD 酶活性越高，即在Cu2+的胁迫下，Cu2+具有诱导EROD 活力的能力，且起着促进作用，这与刘志[15]的研究结论相似。重金属Co、V和Ba 的含量与E2 呈显著负相关（p＜0.05），相关系数分别为-0.44，-0.42，-0.51；Cd 的含量与E2 呈极显著负相关（p＜0.01）相关系数为-0.67，重金属元素对雌二醇的影响能力大小为Cd＞Ba＞Co＞V，Cd、Co、V 和Ba 的含量越高，雌二醇的含量越低，Cd 元素的影响最大；As 的含量与T 睾酮呈显著正相关（p＜0.05），相关系数为0.41，重金属元素的含量与GST 酶活力不存在相关性。

表4 D 地区鲈鱼体内重金属与MT，GST，EROD，E2，T 睾酮的相关性分析

2.5 E 地区鲈鱼体内重金属与MT，GST，EROD，E2，T 睾酮的相关性分析

E 地区鲈鱼体内重金属与MT，GST，EROD，E2，T 睾酮的相关性分析见表5。

由表5 可知，E 地区重金属Ni、V、Cr、Mn、Ba 的含量，As 含量与MT 呈显著正相关（p＜0.05），相关系数分别为0.47，0.49，0.47，0.47，0.46，0.42，该水域内重金属元素与金属硫蛋白的结合能力依次为V＞Ni=Cr=Mn＞Ba＞As，其中重金属元素V 与金属硫蛋白的结合能力最强，As 的结合能力最弱；重金属Pb 的含量与GST 呈显著正相关（p＜0.05），相关系数为0.45，重金属元素Pb 的含量在一定范围内，在Pb2+的胁迫作用下，其能够促进GST 酶的活力提升，还有研究人员研究发现在Pb2+胁迫作用下河蚬GST 酶活力显著的高于对照组（p＜0.05），这与该研究结论相一致。可以根据鲈鱼体内GST 酶活力作为来监测水体中重金属Pb2+的污染情况，该水域的重金属元素与雌二醇及睾酮的含量不存在相关性。